細胞增殖分析（CCK-8 法）

原理

CCK-8 是 MTT 的升級產(chǎn)品，其基本原理為：該試劑中含有WST-8【化學(xué)名：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑單鈉鹽】，它在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓*（1-Methoxy PMS）的作用下被細胞中的線(xiàn)粒體內的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲瓚產(chǎn)物（Formazan dye）。

生成的甲瓚物的數量與活細胞的數量成正比，與細胞毒性成反比，間接反映活細胞數量。因此可利用這一特性直接進(jìn)行細胞增殖和毒性分析。

用途

用于細胞增殖測定、細胞毒性測定、藥物篩選、抗腫瘤藥物敏感性測定。

材料與儀器

【材料】細胞懸液

【試劑】 CCK8

【儀器，耗材】96 孔板，二氧化碳培養箱，酶標儀

步驟

1、取對數生長(cháng)期的細胞制備細胞懸液，細胞計數；

2、根據合適的鋪板細胞數接種到 96 孔板中，每孔約 200 ul（2×103-2×104/孔）細胞懸液，同樣的樣本可做 3-5 個(gè)重復，將 96 孔板在 37℃、5%CO2 培養箱中培養 24,48,72 h；

3、設置空白對照組：不加細胞只加培養液的空白對照，其他試驗步驟保持一致。細胞接種后貼壁大約需要培養4-8小時(shí)；

4、加入20ul CCK8：由于每孔加入CCK8 量比較少，有可能因試劑沾在孔壁上而帶來(lái)誤差，建議在加完試劑后輕輕敲擊培養板以幫助混勻?；蛘咧苯优渲煤?10% CCK8 的培養基，以換液的形式加入；

5、培養1-4小時(shí):細胞種類(lèi)不同，形成的Formazan的量也不一樣。如果顯色不夠的話(huà)，可以繼續培養，以確認最佳條件。特別是血液細胞形成的Formazan很少，需要較長(cháng)的顯色時(shí)間（5-6小時(shí)）；

6、測定 450 nm吸光度：建議采用雙波長(cháng)進(jìn)行測定，檢測波長(cháng) 450-490 nm，參比波長(cháng)600-650 nm。

注意事項

1、當在培養箱內培養時(shí)，培養板最外一圈的孔最容易干燥揮發(fā)，由于體積不準確而增加誤差。一般情況下，最外一圈的孔加培養基或者PBS，不作為測定孔用。避免邊緣效應。     

2、用酶標儀檢測前需確保每個(gè)孔內沒(méi)有氣泡，否則會(huì )干擾測定，且要擦拭干凈樣品板。

3、細胞種板數不易過(guò)多，否則細胞自身發(fā)生接觸抑制，影響OD數值，較長(cháng)培養時(shí)間建議每孔加入200 μl培養基。                                    

4.若暫時(shí)不測定OD值，可以向每孔中加入10 μL 0.1M的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液，并遮蓋培養板避光保存在室溫條件下。24 小時(shí)內測定，吸光度不會(huì )發(fā)生變化。                 

5、懸浮細胞由于染色比較困難，一般需要增加細胞數量和延長(cháng)培養時(shí)間。

6、加入CCK-8 時(shí)，如果細胞培養時(shí)間較長(cháng)，培養基顏色或 pH 值已變化，建議換用新鮮的培養基。

常見(jiàn)問(wèn)題

Q：96 孔板最邊緣的細胞吸光值都較大？

A：這是邊緣效應導致的，長(cháng)時(shí)間培養過(guò)程中，一般邊緣的孔中培養基揮發(fā)較多，培養基中各成分相對濃縮，細胞生長(cháng)會(huì )更快，不能正確反映真實(shí)的細胞生長(cháng)速度，所以需要棄用周?chē)蝗装?，加入培養基或 PBS。