細胞毒性分析

原理

以CCK-8法為例簡(jiǎn)述其原理：CCK-8試劑盒中含水溶性四唑鹽WST-8 (化學(xué)名：2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑單鈉鹽)，WST-8在電子載體1-Methoxy PMS存在的條件下，活細胞線(xiàn)粒體中的脫氫酶催化WST-8生成高度水溶性的橙黃色甲瓚燃料，而甲臜染料的生成量與活細胞的數量成線(xiàn)性關(guān)系。

用途

1、藥物篩選實(shí)驗；
2、腫瘤藥敏試驗；
3、生物活性因子的活性檢測；
4、細胞增殖測定等；

材料與儀器

【材料】細胞懸液，化合物溶液、CCK8試劑、*培養基、PBS、0.25%Trypsin-EDTA

【儀器，耗材】96孔板，二氧化碳培養箱，檢測波長(cháng)450-490nm酶標儀

步驟

1、根據具體細胞類(lèi)型確定其在 96 孔板種植密度，以對照組細胞密度至檢測時(shí)達到 70%-90%為參照，每組設置 3-6 個(gè)復孔，孔板邊緣空不用，加入與培養基等體積的無(wú)菌 PBS 溶液；

2. 每孔加入培養基體積 1/10的CCK-8 溶液。若起始的培養體積為 200 微升，則需加入 20 微升 CCK-8 溶液，其它情況以此類(lèi)推。同時(shí)以加了相同體積細胞培養液和 CCK-8 溶液但沒(méi)有細胞的孔作為空白對照。若所用藥物會(huì )干擾檢測結果，則選加入等體積細胞培養液、藥物和CCK-8溶液但無(wú)細胞的孔作為空白對照（注意不可產(chǎn)生氣泡）；

3. 在細胞培養箱內繼續孵育 2-4 小時(shí)，建議選取2、3、4小時(shí)后分別用酶標儀檢測，然后選取吸光度范圍比較適宜的一個(gè)時(shí)間點(diǎn)用于后續實(shí)驗；

4. 在 450 nm測定吸光度。如無(wú) 450 nm濾光片，可以使用 420-480 nm的濾光片?？梢允褂么笥?600 nm的波長(cháng)，例如 650 nm，作為參考波長(cháng)進(jìn)行雙波長(cháng)測定。

注意事項

1、本實(shí)驗使用96孔板進(jìn)行檢測，周?chē)蝗ψ钊菀渍舭l(fā)，檢測會(huì )因體積不準確而增加誤差故棄用周?chē)蝗?，加入等體積相同量的PBS、水或培養液；

2、本試劑盒的檢測依賴(lài)于脫氫酶催化的反應，因而還原劑(例如一些抗氧化劑)會(huì )干擾檢測，如果待檢測體系中存在較多的還原劑，需設法去除。

3、用酶標儀檢測前需確保每個(gè)孔內沒(méi)有氣泡，否則會(huì )干擾測定；

4、酚紅和血清對CCK-8法的檢測不會(huì )造成干擾，可以通過(guò)扣除空白孔中本底的吸光度而消去；

5、試劑有一定的毒性，請穿好實(shí)驗服并戴一次性手套操作；

6、試劑要注意避光4oC或-20oC保存；

常見(jiàn)問(wèn)題

1. 如果細胞生長(cháng)較慢，且細胞較小，可以最大接種1x10^4 cells/well，但加入化合物后處理時(shí)間最長(cháng)為72 h。

2. 化合物如果難溶于水，可以在培養基中適當添加DMSO、DMF以助溶，但最大濃度不宜超過(guò)0.5%，因為DMSO和DMF對細胞也有一定的毒性。如果使用DMSO、DMF助溶，需保證其他濃度的化合物DMSO、DMF的濃度也相同。

3.若吸光度值太低，怎么辦法？
1）適當增加細胞數量；
2）延長(cháng)加入CCK-8溶液后的孵育時(shí)間