細胞增殖與毒性檢測實(shí)驗方法及經(jīng)驗總結-CCK-8 法

實(shí)驗原理：

Cell Counting Kit-8（簡(jiǎn)稱(chēng)CCK-8）試劑可用于簡(jiǎn)便而準確的細胞增殖和毒性分析。其基本原理為：該試劑中含有WST-8【化學(xué)名：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑單鈉鹽】，它在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓*（1-Methoxy PMS）的作用下被細胞中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲瓚產(chǎn)物（Formazan dye）。生成的甲瓚物的數量與活細胞的數量成正比。因此可利用這一特性直接進(jìn)行細胞增殖和毒性分析。

一、用途：

            藥物篩選、

            細胞增殖測定、

            細胞毒性測定、

            腫瘤藥敏試驗等。

二、優(yōu)點(diǎn)：

· 使用方便，省去了洗滌細胞，不需要放射性同位素和有機溶劑；

· CCK-8法能快速檢測；

· CCK-8法的檢測靈敏度很高，甚至可以測定較低細胞密度；

· CCK-8法的重復性?xún)?yōu)于MTT 法，MTT 實(shí)驗生成的formazan 不是水溶性的，需要使用DMSO 等有機溶劑溶解；

· 而本方法產(chǎn)生的formazan 是水溶性的，不僅省去了溶解步驟，更因此而減少了該操作步驟帶來(lái)的誤差；

· CCK-8法對細胞毒性小，可以多次測定選取最佳測定時(shí)間，與MTT 方法相比線(xiàn)性范圍更寬，靈敏度更高；

· CCK-8細胞活性檢測試劑中為1瓶溶液，毋需預制，即開(kāi)即用。

三、所需設備及儀器：

1. 10ul，100-200ul及多通道移液器

2. 酶標儀（帶有450nm濾光片）

3. 96孔培養板

4. 二氧化碳培養箱

四、方法及步驟：

實(shí)驗一：細胞增殖分析

1、制備細胞懸液：細胞計數。

2、接種到96孔板中：根據合適的鋪板細胞數（約1-2×104），每孔約100ul細胞懸液，同樣的樣本可做4-6個(gè)重復。

3、37℃培養箱中培養：細胞接種后貼壁大約需要培養4小時(shí)，如果不需要貼壁，這步可以省去。

4、加入10ul CCK8：由于每孔加入CCK8量比較少，有可能因試劑沾在孔壁上而帶來(lái)誤差，建議將槍頭浸入培養液中加入且在加完試劑后輕輕敲擊培養板以幫助混勻?；蛘咧苯优渲煤?0%CCK8的培養基（現用現配），以換液的形式加入。

5、培養0.5-4小時(shí):細胞種類(lèi)不同，形成的Formazan的量也不一樣。如果顯色不夠的話(huà)，可以繼續培養，以確認最佳條件（建議預實(shí)驗先摸清楚時(shí)間點(diǎn)）。特別是血液細胞形成的Formazan很少，需要較長(cháng)的顯色時(shí)間（5-6小時(shí)）。

6、測定450nm吸光度：建議采用雙波長(cháng)進(jìn)行測定，檢測波長(cháng)450-490nm，參比波長(cháng)600-650nm。

實(shí)驗二：細胞毒性分析

1、制備細胞懸液：細胞計數

2、接種到96孔板中：根據合適的鋪板細胞數（約≥5×104），每孔約100ul細胞懸液，同樣的樣本可做4-6個(gè)重復。

3、37℃培養箱中培養：細胞接種后貼壁大約需要培養4小時(shí)，如果不需要貼壁，這步可以省去。

4、加入不同濃度的毒性物質(zhì)。

5、37℃培養箱中培養：加入毒性物質(zhì)的培養時(shí)間，要看毒性物質(zhì)的性質(zhì)和細胞的敏感性，一般要根據細胞周期來(lái)決定，起碼要一代以上的時(shí)間（例如：6、12、24、48、60、72小時(shí)）。

6、加入10ul CCK8：由于每孔加入CCK8量比較少，有可能因試劑沾在孔壁上而帶來(lái)誤差，建議將槍頭浸入培養液中加入且在加完試劑后輕輕敲擊培養板以幫助混勻。

7、培養0.5-4小時(shí):細胞種類(lèi)不同，形成的Formazan的量也不一樣。如果顯色不夠的話(huà)，可以繼續培養，以確認最佳條件。特別是血液細胞形成的Formazan很少，需要較長(cháng)的顯色時(shí)間（5-6小時(shí)）。

8、測定450nm吸光度：建議采用雙波長(cháng)進(jìn)行測定，檢測波長(cháng)450-490nm，參比波長(cháng)600-650nm。

五、實(shí)驗注意事項：

· 若暫時(shí)不測定OD值，可以向每孔中加入10 μL 0.1M的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液，并遮蓋培養板避光保存在室溫條件下。24小時(shí)內測定，吸光度不會(huì )發(fā)生變化。

· 如果待測物質(zhì)有氧化性或還原性的話(huà)，可在加CCK8之前更換新鮮培養基（除去培養基，并用培養基洗滌細胞兩次，然后加入新的培養基），去掉藥物影響。當然藥物影響比較小的情況下，可以不更換培養基，直接扣除培養基中加入藥物后的空白吸收即可。

· 當使用標準96孔板時(shí)，貼壁細胞的最小接種量至少為1,000 個(gè)/孔 (100 μl 培養基)。檢測白細胞時(shí)的靈敏度相對較低，因此推薦接種量不低于2,500 個(gè)/孔 (100 μl 培養基)。

· 酚紅和血清對CCK8法的檢測不會(huì )造成干擾，可以通過(guò)扣除空白孔中本底的吸光度而消去。

· CCK8可以檢測大腸桿菌，但不能檢測酵母細胞。在細胞增殖實(shí)驗每次測定的過(guò)程中需要避免細菌污染，以免影響結果。

· CCK-8在0-5℃下能夠保存至少6個(gè)月，在-20℃下避光可以保存1年。

· 當在培養箱內培養時(shí)，培養板最外一圈的孔最容易干燥揮發(fā)，由于體積不準確而增加誤差。一般情況下，最外一圈的孔加培養基或者PBS，不作為測定孔用。

· 在培養基中加入CCK8，培養一定的時(shí)間，測定450 nm的吸光度即為空白對照。在做加藥實(shí)驗時(shí)，還應考慮藥物的吸收，可在加入藥物的培養基中加入CCK8，培養一定的時(shí)間，測定450 nm的吸光度作為空白對照。

· 金屬對CCK-8顯色有影響：當終濃度為1 mM的氯化亞鉛、氯化鐵、硫酸銅會(huì )抑制5%、15%、90%的顯色反應，使靈敏度降級。如果終濃度是10 mM的話(huà)，將會(huì )100%抑制。

· 懸浮細胞由于染色比較困難，一般需要增加細胞數量和延長(cháng)培養時(shí)間。

· 加入CCK-8 時(shí)，如果細胞培養時(shí)間較長(cháng)，培養基顏色或pH 值已變化，建議換用新鮮的培養基。

·  用酶標儀檢測前需確保每個(gè)孔內沒(méi)有氣泡，否則會(huì )干擾測定，且要擦拭干凈樣品板了。

六、經(jīng)驗總結及分享：

CCK8的說(shuō)明書(shū)大家一定要認真閱讀，里面很多細節的問(wèn)題都有提到。而且說(shuō)明書(shū)里提供的一些關(guān)于各種細胞的種板數都很有參考價(jià)值，因為那是反復驗證過(guò)的最佳數值。但無(wú)論如何，做這個(gè)試驗一定要摸條件。你就算再懶，這個(gè)懶不得，否則你都只是在做無(wú)用功。以下言論全部以細胞毒性試驗為前提， 如果你做的是促進(jìn)細胞生長(cháng)的藥物的藥效實(shí)驗那就另當別論了。

摸條件包括1、種板數；2、種板后細胞的貼壁生長(cháng)時(shí)間；3、加藥后的孵育時(shí)間；4、cck8試劑加入量；5、cck8試劑加入后細胞孵育時(shí)間?？雌饋?lái)很多，其實(shí)這就是一個(gè)實(shí)驗。而且都是種的空白板，也就是不加藥物，只加細胞和CCK8。

1、種板數：這個(gè)要查文獻，看你所用細胞別人有無(wú)做過(guò)，把范圍大致找出。記住還要參考說(shuō)明書(shū)，這個(gè)很重要。然后稀釋一系列濃度種板。首先你要觀(guān)察多長(cháng)時(shí)間細胞可貼壁*，一般貼壁生長(cháng)24小時(shí)。然后還有在你的實(shí)驗時(shí)間內，不同細胞數下孔內生長(cháng)情況。比如我擬定考察4天的時(shí)間，那么在4天內，細胞是剛好鋪滿(mǎn)還是堆積生長(cháng)？因為每塊板都會(huì )設置對照孔，也就是含有細胞的培養基+CCK8，這個(gè)數值是板上的最大數值，CCK8試驗最佳OD值在1.0附近，所以這個(gè)最大數值最好能控制在1.0左右。我的實(shí)驗經(jīng)驗是不要讓細胞長(cháng)滿(mǎn)，一旦長(cháng)滿(mǎn)了很難去判斷是否堆積生長(cháng)了，對藥物能否順利進(jìn)入細胞有影響此為其一，其二生長(cháng)不均勻易導致孔間OD值數據偏差大，而且OD值也很大。

2、貼壁生長(cháng)的時(shí)間我一般就直接讓它貼壁長(cháng)24h了，這個(gè)時(shí)間細胞已經(jīng)貼壁*，而且這樣設置時(shí)間對自己安排實(shí)驗時(shí)間也方便。沒(méi)人愿意大半夜爬起來(lái)做實(shí)驗吧。

3、加藥后的孵育時(shí)間，我的實(shí)驗摸了3個(gè)時(shí)間，24h，48h，72h。然后根據數據的穩定性（RSD）、OD值的范圍（1.0左右）這些來(lái)選擇最為好的時(shí)間。太長(cháng)了就沒(méi)有必要了，細胞呆在孔里幾天不換液結果可想而知了。

4、CCK8試劑加入量，說(shuō)明書(shū)中明確寫(xiě)出建議加入量為培養基體積的10%。這里有一個(gè)問(wèn)題：假設我要孔內是200微升的體系，即細胞懸液+藥液+CCK8=200微升呢，還是細胞懸液+藥液=200微升，cck8不算在體系內呢。關(guān)于這一點(diǎn)文獻報道不一致。本人最終采用的是后者。

5、cck8試劑加入后孵育時(shí)間，隨著(zhù)時(shí)間的增加，OD值就會(huì )增大?？傊瓌t就是把OD值控制在1.0左右。這里我考察了0.5h、1.0h、2.0h。

再說(shuō)一下關(guān)于種板設置問(wèn)題。眾人周知周?chē)蝗滓驗檫吘壭际遣挥脕?lái)做實(shí)驗的。一般每組樣品我會(huì )設置6個(gè)復孔，得到的OD值去掉最大值與最小值，其余取平均值。我用的是排槍?zhuān)瑫?huì )省很多力氣，但是也會(huì )增大組內誤差。這個(gè)只有通過(guò)校正移液槍和選用最適槍頭了。

做這個(gè)實(shí)驗我想大家遇到的最大問(wèn)題應該是數據不穩定，組內數據偏差大。講了很多怎樣摸條件，其實(shí)就一個(gè)原則，把OD值控制在1.0左右。數據不穩定也只能通過(guò)增大樣品數，借助數據處理來(lái)彌補。還有實(shí)驗操作一定要仔細小心，盡量平行操作。

補充： 突然想起用酶標儀檢測的時(shí)候還有一些細節問(wèn)題。比如孔里不能有氣泡，如果有氣泡，就用吸耳球吹掉，氣泡會(huì )很影響檢測結果。樣品板要擦拭干凈，當然了，蓋子一定要記得拿掉啊Big Smile補充說(shuō)明：這幾天有同學(xué)提出了一個(gè)問(wèn)題，這個(gè)問(wèn)題非常好也非常關(guān)鍵：將OD值控制在1.0這個(gè)說(shuō)法是否有依據？

這里我還是想提醒大家一定要認真閱讀試劑盒的說(shuō)明書(shū)，試想一個(gè)試劑盒的上市并且作為技術(shù)手段得到認可需要經(jīng)過(guò)多少試驗反復驗證。我購買(mǎi)的是同仁化學(xué)研究所的CCK8試劑盒，說(shuō)明書(shū)的P7Q23：OD值在什么范圍比較合適？答：一般情況下OD值在0.1-2.0都可以，在1.0附近比較好。

再說(shuō)到自己的實(shí)驗設計，酶標儀的原理其實(shí)和紫外分光光度計是一樣的，所以UV上很多減小誤差的注意事項在酶標儀上同樣受用。這就能夠理解為什么不能有氣泡，為什么要擦拭干凈樣品板了。再者熟悉UV原理的同學(xué)會(huì )了解利用紫外檢測有一個(gè)最佳檢測范圍，超過(guò)了這個(gè)范圍，數值就會(huì )呈現出不穩定，無(wú)規律。（大家可以把自己的數據統計分析看看是不是數值控制在1.0附近更穩定。）而更有甚者就是超出了儀器的檢測范圍，儀器讀數為—。我在摸條件的時(shí)候，cck8加入2.0h后檢測就出現過(guò)酶標儀讀不出數據的情況。

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