免疫組化IHC實(shí)驗經(jīng)驗總結

1、免疫組化實(shí)驗所用的組織和細胞標本有哪些？

實(shí)驗所用主要為組織標本和細胞標本兩大類(lèi)，前者包括石蠟切片（病理大片和組織芯片）和冰凍切片，后者包括組織印片、細胞爬片和細胞涂片。其中石蠟切片是制作組織標本最為常用、最基本的方法，對于組織形態(tài)保存好，且能作連續切片，有利于各種染色對照觀(guān)察；還能長(cháng)期存檔，供回顧性研究；石蠟切片制作過(guò)程對組織內抗原暴露有一定的影響，但可進(jìn)行抗原修復，是免疫組化中最佳的組織標本制作方法。

2、石蠟切片為什么要做抗原修復？有哪些方法？

石蠟切片標本均用甲醛固定，使得細胞內抗原形成醛鍵、羧甲鍵而被封閉了部分抗原決定簇，同時(shí)蛋白之間發(fā)生交聯(lián)而使抗原決定簇隱蔽。所以要求在進(jìn)行IHC染色時(shí)，需要*行抗原修復或暴露，即將固定時(shí)分子之間所形成的交聯(lián)破壞，而恢復抗原的原有空間形態(tài)。常用的抗原修復方法有微波修復法，高壓加熱法，酶消化法，水煮加熱法等，常用的修復液是pH6.0的0.01 mol/L的檸檬酸鹽緩沖液。

3、免疫組化常用的染色方法有哪些？

根據標記物的不同分為免疫熒光法，免疫酶標法，親和組織化學(xué)法，后者是以一種物質(zhì)對某種組織成分具有高度親合力為基礎的檢測方法。這種方法敏感性更高，有利于微量抗原(抗體)在細胞或亞細胞水平的定位，其中生物素——抗生物素染色法最為常用。

4、石蠟切片在染色過(guò)程中出現脫片現象

1）烤片時(shí)間不夠，或溫度不夠，可以延長(cháng)烤片時(shí)間和提高烤片溫度； 

2）用含有多聚賴(lài)氨酸的玻片，可以購買(mǎi)到或這自己做；

3）有些組織本身就容易掉片，如骨組織等，操作時(shí)沖PBS不要直接沖到組織上，沖到組織上方，讓它流下沖洗組織； 

4）用高溫修復時(shí)，溫度驟冷也可能引起。 

5、邊緣效應

1）組織邊緣與玻片粘貼不牢，邊緣組織松脫漂浮在液體中，每次清洗不易將組織下面試劑洗盡所致. 解決辦法：制備優(yōu)質(zhì)的膠片（APES或多聚賴(lài)氨酸），切出盡量薄的組織切片，不厚于4微米，組織的前期處理應規范，盡量避免選用壞死較多的組織；

2）切片上滴加的試劑未充分覆蓋組織，邊緣的試劑容易首先變干，濃度較中心組織高而致染色深。解決辦法：試劑要充分覆蓋組織，應超出組織邊緣2mm。用組化筆畫(huà)圈時(shí)，為了避免油劑的影響，畫(huà)圈應距組織邊緣3-4mm。

6、產(chǎn)生組織切片非特異性染色

1）抗體孵育時(shí)間過(guò)長(cháng)、抗體濃度高易增加背景著(zhù)色。這可通過(guò)縮短一抗/二抗孵育時(shí)間、稀釋抗體來(lái)控制。這是最重要的一條； 

2）一抗用多克隆抗體易出現非特異性著(zhù)色，建議試用單克隆抗體看看； 

3）內源性過(guò)氧化物酶和生物素在肝臟、腎臟等組織含量很高（含血細胞多的組織），需要通過(guò)延長(cháng)滅活時(shí)間和增加滅活劑濃度來(lái)降低背景染色； 

4）非特異性組分與抗體結合，這需要通過(guò)延長(cháng)二抗來(lái)源的動(dòng)物免疫血清封閉時(shí)間和適當增加濃度來(lái)加強封閉效果； 

5）DAB孵育時(shí)間過(guò)長(cháng)或濃度過(guò)高； 

6）PBS沖洗不充分，殘留抗體結果增強著(zhù)色，在一抗、二抗或SP孵育之后的浸洗尤為重要； 

7）標本染色過(guò)程中經(jīng)常出現干片，這容易增強非特異性著(zhù)色。

7、免疫組化染色呈陰性結果

1）抗體濃度和質(zhì)量問(wèn)題以及抗體來(lái)源選擇錯誤；   

2）抗原修復不全，對于甲醛固定的組織必須用充分抗原修復來(lái)打開(kāi)抗原表位，以利于與抗體結合；建議微波修復用高火4次*6min試試。有人做過(guò)實(shí)驗，這是最佳的時(shí)間和次數。若不行，還可高壓修復； 

3）組織切片本身這種抗原含量低；

4）血清封閉時(shí)間過(guò)長(cháng)；

5）DAB孵育時(shí)間過(guò)短；

6）細胞通透不全，抗體未能充分進(jìn)入胞內參與反應；

7）開(kāi)始做免疫組化，我建議你一定要首先做個(gè)陽(yáng)性對照片，排除抗體等外的方法問(wèn)題。

8、背景

1）考慮一抗濃度高；

2）然后調整DAB孵育時(shí)間；

3）也要考慮血清封閉時(shí)間是否過(guò)短；

4）適當增加抗體孵育后的浸洗次數和延長(cháng)浸洗時(shí)間等。

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