細胞凍存相關(guān)實(shí)驗操作詳解

一個(gè)實(shí)驗室得到一個(gè)新的細胞株后，首先要把該細胞株培養擴增后凍存起來(lái)。細胞凍存首先可以在由于污染等情況丟失細胞時(shí)有備份可用，另外幾乎所有細胞在培養傳代的過(guò)程中發(fā)生一定程度的變異，為了保持實(shí)驗結果的一致，一般細胞在培養幾十代以后就不能再使用了，需要將凍存的，傳代較少的細胞化凍培養再使用。

細胞冷凍過(guò)程有四個(gè)要點(diǎn)：細胞的收獲、保護劑的使用、冷凍速率和儲存環(huán)境。

用來(lái)凍存的細胞一般選擇在細胞約鋪滿(mǎn) 90% 的時(shí)候，這時(shí)細胞生長(cháng)狀態(tài)好，細胞數量也多，并且在收獲細胞前 24 小時(shí)換一次培養液。收獲用來(lái)凍存的細胞開(kāi)始時(shí)方法和平時(shí)一樣，用 100xg 離心 5 分鐘收集細胞再重懸，活細胞記數。稀釋或濃縮到細胞保存的最終細胞濃度的二倍(一般是 400-1000 萬(wàn) 細胞 /ml )，加入已經(jīng)配好的等體積的培養液保護劑混合溶液中輕輕混勻，分裝到凍存管，冷凍保存。

細胞凍存中， 一般使用DMSO 作為保護劑。在細胞凍存中， DMSO 使用的最終濃度一般是 5-15% ，某種具體細胞的凍存液中的DMSO濃度可以從ATCC查到。對特別敏感的細胞特別是雜交瘤細胞在凍存時(shí)使用 95% 血清和 5%DMSO 可能會(huì )好些。保護劑在使用時(shí)先用培養液或血清配成最終濃度的2倍，再與等體積的懸浮細胞的培養液混合。

細胞的冷凍速率最適控制在讓細胞有足夠的時(shí)間脫水而又不被過(guò)度脫水導致細胞損害。對大多數細胞來(lái)說(shuō)，每分鐘降 1 至 3 ℃是合適的。通常的操作是把細胞先在-20℃1-2個(gè)小時(shí)，再放入 -80℃冰箱過(guò)夜(如果沒(méi)有-80℃冰箱，可以用干冰替代)，再轉入液氮罐或低于 -130℃的冰箱長(cháng)期保存。

細胞長(cháng)期保存溫度是 -130 ℃或更低。液氮罐中氣態(tài)層溫度在 -140℃至 -180℃之間，細胞可保存在氣態(tài)層或浸入液氮中，如果可能最好保存在氣態(tài)層，因為這樣可避免由于有液氮進(jìn)入凍存管而在拿出細胞時(shí)引起爆炸(但是這樣液氮罐內只能存儲少量液氮，需要經(jīng)常添加)。細胞也可以在-80℃冰箱保存幾個(gè)月左右的時(shí)間。

●  化凍過(guò)程的原則是要讓凍存的細胞快速融化。

●  如果細胞儲存在液氮液面下，使用者最好準備好必要的防護器具(至少要戴上護目鏡，最好戴上面罩和較厚的手套)，防止進(jìn)入凍存管的液氮驟然膨脹引起爆炸而造成傷害。從冰箱或液氮罐取出細胞后將凍存管放37℃水浴輕輕晃動(dòng)使之化凍*，注意不要讓水浸到蓋子以防污染發(fā)生。

●  由于大多防凍劑與細胞長(cháng)時(shí)間接觸時(shí)對細胞有毒害，所以最好盡快除去細胞凍存時(shí)加入的防凍劑。

●  防凍劑的去除方式和細胞的敏感性有關(guān)。有些細胞在某些防凍劑存在的條件下能很好的貼壁生長(cháng)，可以直接將化凍的凍存細胞連同其凍存液加入預備好15-20ml

培養液的細胞培養瓶或培養皿中，輕輕混勻后放入培養箱培養過(guò)夜后換培養液。

●  對于敏感細胞要加入 10ml 培養液中， 100xg 離心 5 分，去上清后加培養液輕輕重懸細胞，加入培養器皿后在培養箱培養，第二天更換培養液。