細胞傳代培養實(shí)驗常見(jiàn)問(wèn)題詳解

收到細胞先不開(kāi)蓋,用酒精將整個(gè)細胞瓶外壁進(jìn)行消毒，放在培養箱靜置若干小時(shí)后(看細胞密度而定)在倒置顯微鏡下觀(guān)察細胞生長(cháng)情況，并對細胞進(jìn)行不同倍數拍照(建議收細胞時(shí)的培養基拍一張照片，觀(guān)察培養基的顏色和是否有漏液情況，顯微鏡下拍細胞100X，200X各兩張)，排除細胞本身污染的情況。

視細胞生長(cháng)密度而定，常規細胞2-3天更換培養基。

一般情況下細胞生長(cháng)至*匯合后就應該傳代，所有細胞生長(cháng)都有一個(gè)要求不宜生長(cháng)過(guò)密(也就是常說(shuō)的長(cháng)老了)，但有接觸抑制的細胞，在匯合前就必須進(jìn)行傳代，這類(lèi)細胞一般在密度70-80%就進(jìn)行傳代，否則會(huì )引起細胞分化。

去掉原T25培養瓶里面的培養基，T25瓶加3-4 ml PBS洗1-2次;棄PBS，再加1.5 ml的Trypsin-EDTA (1X)消化液消化細胞，顯微鏡下觀(guān)察，待細胞變圓，細胞間隙明顯，部分細胞剛開(kāi)始脫離瓶壁，加4 ml左右*培養液混勻終止消化，將細胞小心吹打下來(lái)，1000 rpm/min室溫離心5min;棄上清，細胞沉淀用*培養液重懸，按要求分瓶(視細胞密度而定1:2-1:3，1:3-1:6，1:6-1:8)，每T25瓶補足培養基至5-6 ml，37℃、5%CO2孵箱培養。

一般僅需持續加入新鮮培養基于原培養角瓶中，稀釋細胞濃度即可，若培養液太多時(shí)，將細胞懸液移入離心管中，1000 rpm/min 室溫離心5 min。棄上清，細胞沉淀用*培養液重懸，按要求分瓶(視細胞密度而定1:4-1:8)，每T25瓶加*培養液至4-5 ml，37℃、5%CO2孵箱培養。有些懸浮細胞趨于成團生長(cháng)，此時(shí)細胞生長(cháng)狀態(tài)良好，當補液時(shí)，需避免反復吹打。

一般使用trypsin-EDTA濃度為0.25% trypsin-0.53 mM EDTA.2Na或0.05%trypsin-0.02 mM EDTA.2Na。消化液濃度過(guò)高時(shí)，易造成培養基中細胞碎片增多，黑渣子增多，常規細胞傳代時(shí)建議用0.05%的胰酶進(jìn)行消化，對于難消化的細胞可采用0.25%胰酶進(jìn)行消化，細胞密度過(guò)高超過(guò)80%時(shí)，采用分步消化法。胰酶儲存在–20°C，解凍在4°C進(jìn)行，第一次開(kāi)瓶后應立即少量分裝于無(wú)菌試管中，保存于–20°C，避免反復冷凍解凍造成trypsin之活性降低，并可減少污染之機會(huì )。

胰酶消化的程度是細胞培養中的一個(gè)關(guān)鍵步驟：消化過(guò)度細胞碎片增多，黑渣子增多，細胞會(huì )成片脫落，嚴重影響細胞活性，并有部分細胞漂浮，隨棄去的胰酶流失;消化不足則細胞難于從瓶壁上吹下，反復吹打同樣也會(huì )損傷細胞活性。

不同細胞對消化液的敏感性不同，胰酶消化的時(shí)間也會(huì )有差異。胰酶消化時(shí)間與胰酶的濃度，是否含EDTA，胰酶的儲存時(shí)間，胰酶的儲存溫度，是否反復凍融，消化加入的胰酶體積，消化溫度及細胞的密度有關(guān)。消化對于新購買(mǎi)的細胞，建議客戶(hù)先用低濃度的胰酶仔細去摸索一下消化時(shí)間，可每隔1分鐘鏡下觀(guān)察細胞是否變圓，記錄最佳消化時(shí)間，下一次操作參考之前的記錄來(lái)控制時(shí)間即可。

細胞傳代或凍存時(shí)欲回收細胞，其離心速度一般為800-1000 rpm/min，室溫離心5-8分鐘，轉速過(guò)高，將造成細胞破裂死亡。

顯微鏡下觀(guān)察：活細胞中間透亮，飽滿(mǎn)，有光澤，死細胞較暗。也可以通過(guò)臺盼藍染色來(lái)計算細胞活力。

用無(wú)血清培養基把細胞懸液稀釋到200～2000 個(gè)/毫升，在0.1 毫升的細胞懸液中加入0.1 毫升的0.4%的臺盼蘭溶液。輕輕混勻，用血球計數板計數細胞?；罴毎懦馀_盼蘭，因而染成藍色的細胞是死細胞，注意計數需在加入臺盼藍10min內完成。有細胞計數儀的，可直接用計數儀進(jìn)行。

EDTA用來(lái)螯合游離的鎂離子和鈣離子，以便保持抑制胰蛋白酶的活性。建議胰蛋白酶處理細胞前，用EDTA清洗細胞，以消除來(lái)自培養基中所有的二價(jià)離子。

不能。每一細胞株均有其特定使用且已適應的細胞培養基，若驟然使用和原先提供之培養條件不同之培養基，細胞大都無(wú)法立即適應，易造成細胞狀態(tài)不好，最終造成細胞無(wú)法存活。

不能。血清是細胞培養上一個(gè)極為重要的營(yíng)養來(lái)源，所以血清的種類(lèi)和品質(zhì)對于細胞的生長(cháng)會(huì )產(chǎn)生極大的影響。來(lái)自不同物種的血清，在一些物質(zhì)或分子的量或內容物上都有所不同，血清使用錯誤常會(huì )造成細胞無(wú)法存活。

細胞傳代后放入培養箱沒(méi)有搖勻，或者放入時(shí)搖勻，但在細胞貼壁前，又移動(dòng)了培養瓶，頻繁開(kāi)關(guān)培養箱引起的振動(dòng)或者培養瓶中培養液過(guò)少，培養箱擱板表面不平整，這些因素會(huì )導致細胞生長(cháng)不均勻。

研究人員在細胞培養時(shí)出現存活率不佳，常見(jiàn)原因可歸納為：培養基使用錯誤或培養基品質(zhì)不佳。血清使用錯誤或血清的品質(zhì)不佳。運輸過(guò)程對細胞有嚴重影響。解凍過(guò)程錯誤。冷凍細胞解凍后，加以洗滌細胞和離心。懸浮細胞誤認為死細胞。培養溫度使用錯誤。細胞置于–80°C太久。

一些懸浮細胞抱團生長(cháng)是正?，F象，大部分懸浮細胞在細胞密度很高的情況下，很可能會(huì )出現部分細胞抱團生長(cháng)的現象，聚團細胞很容易死亡并演化成絮狀物，殃及周?chē)膽腋〖毎?，因此在培養懸浮細胞時(shí)需控制好細胞密度。如果出現了細胞團，可以通過(guò)細胞篩去掉部分較大的細胞團，也可以嘗試一下方法：將細胞懸液收集到15 ml離心管中，靜置20 min左右，小心取上層細胞上清培養(該方法只能去除部分較大的細胞團)。

部分細胞本身存在一定的空泡(如HepG2，Ishikawa及一些耐藥株等)，這個(gè)是正?，F象。如果只有少數細胞有內出現極少空泡，則很可能是細胞狀態(tài)不佳，可以通過(guò)調整血清濃度，控制消化，控制傳代比例及時(shí)間等方法來(lái)調整細胞狀態(tài);如果大部分細胞出現空泡，且單個(gè)細胞內空泡數目偏多，則可能細胞代次較高，細胞老化所致，需更換代次較早的細胞。

很可能是培養體系不適合細胞(未使用推薦的培養體系);或者消化過(guò)度，對細胞有嚴重影響;或者是傳代比例不合適(具有密度依賴(lài)性的細胞，傳代太稀;或者生長(cháng)較快的細胞，傳代較密，細胞嚴重堆疊生長(cháng))。

細胞增殖變慢有以下原因：1. 消化過(guò)度 2. 傳代過(guò)密 3.細胞營(yíng)養不良 4.細胞頻繁傳代 5.細胞狀態(tài)不佳或老化 6.細胞存在污染。

一般培養基中大都使用HCO3-/CO32-/H+作為pH的緩沖系統，而培養基中NaHCO3的含量將決定細胞培養時(shí)應使用的CO2濃度。當培養基中NaHCO3含量為每公升3.7 g時(shí)，細胞培養時(shí)應使用10% CO2;當培養基中NaHCO3為每公升1.5 g時(shí)，則應使用5% CO2培養細胞。

定期(每周一次)更換水盤(pán)里面的水，水盤(pán)的水必須使用無(wú)菌蒸餾水或無(wú)菌去離子，水盤(pán)中可添加1%硫酸銅以預防霉菌污染。

依照細胞株基本數據上的接種密度或稀釋分盤(pán)的比例接種即可。細胞數太少或稀釋的太多亦是造成細胞無(wú)法生長(cháng)的一個(gè)重要原因。按照我們的經(jīng)驗：一般倍增時(shí)間24 h內的細胞，傳代比率1:6-1:12為宜，倍增時(shí)間24-48 h的細胞，傳代比率1:3-1:8為宜，倍增時(shí)間超過(guò)48h的細胞, 傳代比率1:2-1:4為宜。

首先肉眼觀(guān)察培養液是否變渾濁，如果變渾濁，基本可以確定是污染;如果肉眼觀(guān)察培養液沒(méi)有變渾濁：在顯微鏡下觀(guān)察黑點(diǎn)大小和形狀是否規則，是否運動(dòng)，是做布朗運動(dòng)還是呈直線(xiàn)型快速移動(dòng)。如果黑點(diǎn)大小不規則，做布朗運動(dòng)，黑點(diǎn)可能是細胞碎片(可能是細胞狀態(tài)不佳或者消化過(guò)度引起的)，也可能是血清反復凍融產(chǎn)生的蛋白沉淀引起的，也可能是細胞的代謝產(chǎn)物。如果黑點(diǎn)大小一致，快速移動(dòng)，很可能是細菌污染。

掌握細胞傳代的最佳時(shí)機，不要細胞長(cháng)老了再傳代;掌握好消化時(shí)間，防止消化過(guò)度產(chǎn)生細胞碎片;減少血清等試劑的凍融次數;將培養液的PH調到最佳;嚴格控制水質(zhì)和器皿的清潔。

如果判定黑點(diǎn)是污染，請及時(shí)將細胞處理后丟棄。其他情況，可參照以下進(jìn)行：

如果是懸浮細胞：收集細胞上清慢速離心(500-600 rpm/min，5-6 min)并更換新的培養瓶;如果是貼壁細胞：將細胞用PBS洗2-3遍，洗的時(shí)候，輕輕拍打培養瓶，讓貼壁不牢的碎片和顆粒脫落，再棄去PBS，消化時(shí)先加低濃度的胰酶如0.05%胰酶消化1 min左右，讓細胞間隙中的顆粒和碎片脫落下來(lái)，去掉低濃度胰酶，然后正常消化細胞，將收集的細胞懸液慢速離心(500-600 rpm/min，5-6 min)并更換新的培養瓶，并可以嘗試適當增加血清濃度進(jìn)行培養。

不同廠(chǎng)牌的dish或flask，其所coating的polymer不同，制造程序亦不同，雖對大部分細胞沒(méi)有太大之影響，惟少數細胞則可能因使用廠(chǎng)牌不同之dish或flask而有顯著(zhù)之生長(cháng)差異。