熒光原位雜交技術(shù)

材料與儀器

人的MyoD1（MYF3)基因探針 人外周血中期染色體細胞標本
指甲油 甲酰胺 氯化鈉 檸檬酸鈉 氫氧化鈉 吐溫20
恒溫水浴鍋 培養箱 染色缸 載玻片 Nikon E-400熒光顯微鏡 蓋玻片 封口膜 200μL移液器 暗盒

步驟

注意事項

相關(guān)溶液的配制

1.20×SSC：175.3 g NaCl，88.2 g檸檬酸鈉，加水至1 000 mL（用10 mol/L NaOH調pH 至7.0）。

2.去離子甲酰胺（DF）：將10 g混合床離子交換樹(shù)脂加入100 mL甲酰胺中。電磁攪拌30 min，用Whatman l號濾紙濾。

3.體積分數70%甲酰胺/2×SSC：35 mL甲酰胺，5 mL 20×SSC，10 mL水。

4.體積分數50%甲酰胺/2×SSC：100 mL甲酰胺，20 mL 20×SSC，80 mL水。

5.體積分數50%硫酸葡聚糖（DS）：65℃水浴中融化，4℃或-20℃保存。

6.雜交液：8 μL體積分數25%DS，20 μL 20×SSC混合。（或40 μL體積分數50% DS，20 μL 20×SSC，40 μL ddH2O混合）取上述混合液50 μL，與5 μL DF混合即成。其終濃度為體積分數10% DS，2×SSC，體積分數50% DF。

7.PI/antifade溶液

PI原液：先以雙蒸水配置溶液，濃度為100 μg/mL，取出1 mL，加39 mL雙蒸水，使終濃度為2.5 μg/mL。Antifade原液：以PBS緩沖液配制該溶液，使其濃度為10 mg/mL，用0.5 mmol/L的NaHCO3調pH值為8.0。取上述溶液1 mL，加9 mL甘油，混勻。

PI/antifade溶液：PI與antifade原液按體積比1:9比例充分混勻，——20℃保存備用。

8.DAPI/antifade溶液：用去離子水配制1mL/mg DAPI儲存液，按體積比1:300，以antifade溶液稀釋成工作液。

9.封閉液I：體積分數5% BSA 3 mL，20×SSC 1 mL，ddH2O 1mL，Tween20 5 μL混合。

10.封閉液II：體積分數5%  BSA 3mL，20×SSC 1mL，goat serum 250 μL，ddH2O 750 μL，Tween20 5 μL混合。

11.熒光檢測試劑稀釋液：體積分數5%  BSA 1mL，20×SSC 1mL，ddH2O 3mL，Tween20 5μL混合。

12.洗脫液：100 mL 20×SSC，加水至500 mL，加Tween20 500 μL。

常見(jiàn)問(wèn)題

相關(guān)溶液的配制

1.20×SSC：175.3 g NaCl，88.2 g檸檬酸鈉，加水至1 000 mL（用10 mol/L NaOH調pH 至7.0）。

2.去離子甲酰胺（DF）：將10 g混合床離子交換樹(shù)脂加入100 mL甲酰胺中。電磁攪拌30 min，用Whatman l號濾紙濾。

3.體積分數70%甲酰胺/2×SSC：35 mL甲酰胺，5 mL 20×SSC，10 mL水。

4.體積分數50%甲酰胺/2×SSC：100 mL甲酰胺，20 mL 20×SSC，80 mL水。

5.體積分數50%硫酸葡聚糖（DS）：65℃水浴中融化，4℃或-20℃保存。

6.雜交液：8 μL體積分數25%DS，20 μL 20×SSC混合。（或40 μL體積分數50% DS，20 μL 20×SSC，40 μL ddH2O混合）取上述混合液50 μL，與5 μL DF混合即成。其終濃度為體積分數10% DS，2×SSC，體積分數50% DF。

7.PI/antifade溶液

PI原液：先以雙蒸水配置溶液，濃度為100 μg/mL，取出1 mL，加39 mL雙蒸水，使終濃度為2.5 μg/mL。Antifade原液：以PBS緩沖液配制該溶液，使其濃度為10 mg/mL，用0.5 mmol/L的NaHCO3調pH值為8.0。取上述溶液1 mL，加9 mL甘油，混勻。

PI/antifade溶液：PI與antifade原液按體積比1:9比例充分混勻，——20℃保存備用。

8.DAPI/antifade溶液：用去離子水配制1mL/mg DAPI儲存液，按體積比1:300，以antifade溶液稀釋成工作液。

9.封閉液I：體積分數5% BSA 3 mL，20×SSC 1 mL，ddH2O 1mL，Tween20 5 μL混合。

10.封閉液II：體積分數5%  BSA 3mL，20×SSC 1mL，goat serum 250 μL，ddH2O 750 μL，Tween20 5 μL混合。

11.熒光檢測試劑稀釋液：體積分數5%  BSA 1mL，20×SSC 1mL，ddH2O 3mL，Tween20 5μL混合。

12.洗脫液：100 mL 20×SSC，加水至500 mL，加Tween20 500 μL。

熒光原位雜交（Fluorescence in situ hybridization FISH）是一門(mén)新興的分子細胞遺傳學(xué)技術(shù)，是20世紀80年代末期在原有的放射性原位雜交技術(shù)的基礎上發(fā)展起來(lái)的一種非放射性原位雜交技術(shù)。目前這項技術(shù)已經(jīng)廣泛應用于動(dòng)植物基因組結構研究、染色體精細結構變異分析、病毒感染分析、人類(lèi)產(chǎn)前診斷、腫瘤遺傳學(xué)和基因組進(jìn)化研究待許多領(lǐng)域。

與傳統的放射性標記原位雜交相比，熒光原位雜交具有快速、檢測信號強、雜交特異性高和可以多重染色等特點(diǎn)，因此在分子細胞遺傳學(xué)領(lǐng)域受到普遍關(guān)注。

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