從96孔微培養板生長(cháng)的哺乳動(dòng)物細胞中分離DNA

材料與儀器

限制性?xún)惹泻怂崦?無(wú) DNase 的 RNase 細胞
細胞裂解緩沖液 乙醇 NaCl 乙醇溶液 磷酸鹽緩沖液 蔗糖凝膠上樣緩沖液 TE
抽氣設備 多通道移液器 溫箱 振搖平臺 Tupperware 容器

步驟

一、材料

1. 緩沖液和溶液

細胞裂解緩沖液（10 mmol/L Tris-Cl (pH 7.5)，10 mmol/L NaCl，0.5% (m/V) Sarkosyl）

乙醇

NaCl/乙醇溶液

磷酸鹽緩沖液（PBS )

蔗糖凝膠上樣緩沖液

TE (pH 8.0)

2. 酶和緩沖液

限制性?xún)惹泻怂崦?br style="border: 0px solid; box-sizing: border-box; --tw-shadow:0 0 #0000; max-width: 100%; background-image: none !important; background-position: initial !important; background-size: initial !important; background-repeat: initial !important; background-attachment: initial !important; background-origin: initial !important; background-clip: initial !important; color: rgb(77, 88, 101) !important; font-size: 0.32rem !important; line-height: 0.5rem !important; margin: 0px !important;"/>
無(wú) DNase 的 RNase

3. 專(zhuān)用設備

與帶閥門(mén)的真空管相連的抽氣設備

多通道移液器，8 或 12 道

溫箱，預設至 60℃。

振搖平臺

Tupperware 容器

4. 細胞和組織

在 96 孔微培養板上生長(cháng)的細胞

二、方法

1. 用藍色尖頭或者巴斯德移液管吸去 96 孔培養板每個(gè)培養孔中的培養液。

只要小心不接觸細胞層，通常不用毎個(gè)培養孔換新的尖頭。

2. 每個(gè)培養孔中的細胞用 100 μl 磷酸鹽緩沖液沖洗 2 次。

3. 用多通道移液器在微培養板的每個(gè)孔中加入 50 μl 細胞裂解液。將數張濕的吸水紙置入一個(gè)聚丙烯盒中（如 Tupperware 盒)，再將盛有細胞裂解液和細胞的微培養板放在吸水紙上，用蓋封嚴盒子。

4. 將封好的盒子在 60℃ 溫箱中溫育 12~16 h。

5. 將盒子移出溫箱，取出培養板平放在工作臺上，冷卻數分鐘，每孔加入 100 μl NaCl/乙醇溶液。不用混勻，直接將培養板于室溫溫育 30 min。溫育末期應見(jiàn)到纖維狀的核酸沉淀。

6. 緩慢地倒轉培養板，將乙醇溶液倒入水池。核酸沉淀應黏附在培養孔的底部。將每個(gè)培養板倒置于干燥的吸水紙上，使殘余乙醇從培養板流出。

7. 每孔加入 150 μl 70% 乙醇，小心不要移動(dòng)核酸沉淀。按步驟 6 倒轉培養板以去除 70% 乙醇。在吸水紙吸去多余的液體。用 70% 乙醇再沖洗沉淀 2 次。

8. 使培養板在室溫干燥直至最后的乙醇揮發(fā)。如果基因組 DNA 將用于 PCR 分析，進(jìn)行步驟 9。如果 DNA 將用于 Southern 雜交，進(jìn)行步驟 10、11 和 12。

9. 每孔加入 30~50 μl TE ( pH 8.0), 室溫緩和地震搖 12~16 h 使 DNA 溶解。

10. 如果 DNA 將用于 Southern 雜交，制備下列限制性?xún)惹泻怂崦富旌衔?；每孔?40 μl。

H2O                                      0.8倍體積

10X限制性?xún)惹泻怂崦妇彌_液   0.1倍體積

無(wú) DNase 的 RNase               10 μg/ml

使用前每 40 μl 混合物加入 10 個(gè)單位限制性?xún)惹泻怂崦浮?br style="border: 0px solid; box-sizing: border-box; --tw-shadow:0 0 #0000; max-width: 100%; background-image: none !important; background-position: initial !important; background-size: initial !important; background-repeat: initial !important; background-attachment: initial !important; background-origin: initial !important; background-clip: initial !important; color: rgb(77, 88, 101) !important; font-size: 0.32rem !important; line-height: 0.5rem !important; margin: 0px !important;"/>
11. 用多通道移液器在每個(gè)孔中加入 40 μl 限制性?xún)惹泻怂崦阜磻旌衔?。反復抽吸數次使孔中內容物混合，小心避免產(chǎn)生氣泡。按步驟 3 用 Tupperware 容器制作濕盒, 將培養板放入，使反應在適宜的消化溫度溫育 12~16 h。

12. 加入 5~10 μl 蔗糖凝膠上樣緩沖液終止反應，進(jìn)行 Southern 印跡和雜交以分析消化的 DNA。

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