CPB沉淀法純化放射性標記的寡核苷酸實(shí)驗

步驟

材料

溶液和緩沖液
稀釋貯存液至適當濃度。

十六烷基溴化吡啶（CPB)1%,m/V)
將 1 gCPBW(sigma 公司）溶于 100 ml 水中，加熱并用磁力攪拌器攪拌溶液可加速溶解。待去污劑全部溶解后，將溶液冷卻至室溫，用硝酸纖維素濾膜過(guò)濾（0.45um 孔徑）

EDTA-Tris(0.5mol/L,pH6.0)
用 60 ml 水溶解 0.1mol EDTA, 在攪拌溶液的同時(shí), 加入 Tris 堿（粉末)，直到溶液 pH 值達到 6.0, 此時(shí) Tris 的濃度為約 1.2mol/L。加水使溶液的體積為 200 mL。這不同于常規配制方法，但對于陽(yáng)離子去污劑有效地沉淀核酸是非常必要的（Sibatani1970)。

EDTA-Tris-DNA 溶液
用 50 mmol/LEDTA-Tris(pH6.0)(1:10 稀釋 0.5mol/LEDTA-Tris 溶液）溶解載體 DNA(鮭精DNA), 使其濃度為 50ug/ml 載體 DNA 應大小均一、不干擾放射性標記核酸與靶 DNA 的雜交。用超聲處理或鮭精 DNA 片段可滿(mǎn)足多數實(shí)驗的要求（超聲處理鮭精 DNA 的長(cháng)度在 600~5000bp，可以從 Pharmacia 公司購得或按第 6 章的方案 10 制備)。

乙醇-乙酸鈉溶液

80%(V/V) 乙醇

20%(V/V) 乙酸鈉（0.1mol/L,pH5.2)

TE(pH7.6) 或適當的預雜交液
見(jiàn)步驟 8。

核酸和寡核苷酸

放射性標記的寡核苷酸

純化的原料是方案 2(步驟 3 或步驟 5) 的反應混合液，T4 噬菌體多核苷酸激酶已在 68°C 滅活。

專(zhuān)用設備

干冰/乙醇浴

方法

1. 含有放射性標記的寡核苷酸的微量離心管中加入 5~10 倍體積的 EDTA-Tris-DNA 溶液，充分混合。
為進(jìn)行有效的沉淀，務(wù)必使終末反應混合液中 EDTA-Tris-DNA 溶液的離子成分占優(yōu)勢，混合液的終體積與放射性標記寡核苷酸的濃度對本方法的效率不產(chǎn)生影響。

2. 加入足量的 1%CPB, 使離心管中混合液的去污劑濃度達到 0.1%, 充分混勻。

3. 將離心管置于干冰/乙醇浴中至混合液凍結。從冰浴中取出離心管，室溫下使混合液融化。

4.4°C 下以最大轉速離心 5 min, 用巴斯德吸管或裝有一次性藍吸頭的微量移液器小心吸去管中的上清。
警惕：上淸中含大部分未摻入的 [γ-32P]ATP。磷酸化反應常使用大于100uCi 的放射性標記 ATP，因此上清中放射性劑量相當可觀(guān)，應小心謹慎處理未摻入的放射性物質(zhì)、移液器吸頭及離心管。

5. 在管中加入 500ul 蒸餾水，振蕩 20s, 再次按步驟 4 離心。

6. 吸去管中上清，加入 500ul 乙醇-乙酸鈉溶液，振蕩 15s，隨后在室溫下以最大轉速離心 2 min。

7. 重復步驟 6。

8. 小心吸去上清。打開(kāi)離心管蓋，放置在試驗臺聚異丁烯酸樹(shù)脂有機玻璃防護屏后，直到剩余可見(jiàn)的乙醇揮發(fā)干凈。用 20~50ulTE(pH7.6) 溶解沉淀的寡核苷酸。如放射性標記的寡核苷酸用作探針，則用小體積預雜交液溶解。