怎么提高電穿孔法轉染的效率？

電穿孔法難點(diǎn)在于提高電穿孔的效率。實(shí)驗操作者一般能從電轉儀廠(chǎng)家得到轉染的詳細方案和優(yōu)化指導。當你需要自己優(yōu)化轉染效率時(shí)，可以從以下方面進(jìn)行：

1、外加電場(chǎng)的強度：電壓過(guò)低，細胞膜不能形成小孔，使得外源分子通過(guò)；電壓過(guò)高，細胞會(huì )受到不可逆損傷，以至于裂解。對于大部分哺乳細胞來(lái)說(shuō)，電壓250～500V/cm是合適的。實(shí)驗操作者需要查詢(xún)資料，找到所需細胞系轉染的合適電場(chǎng)強度。

這部分的操作建議通過(guò)逐級增加電壓來(lái)確定*佳轉染電場(chǎng)強度。

2、電脈沖時(shí)間的長(cháng)短：一般電脈沖只進(jìn)行1次。根據電轉儀的具體參數設置，不同儀器間差異較大。

3、溫度：細胞在室溫時(shí)電轉染，瞬時(shí)表達水平*高；對于高強度電轉，產(chǎn)生大量熱量的實(shí)驗來(lái)說(shuō)，將細胞保持在0°C較好，但電轉染后需要室溫孵育一段時(shí)間。

4、DNA：線(xiàn)性DNA比環(huán)形DNA的轉染效率高，合適濃度是1～40μg/mL。使用質(zhì)粒時(shí)，需要提高質(zhì)粒的純度。

5、培養基：用緩沖鹽溶液（HEPES鹽緩沖液）懸浮細胞的轉染效率較高，比使用含非離子物質(zhì)（甘露糖、蔗糖）的緩沖液高數倍。

6、細胞狀態(tài)：最好使用生長(cháng)活躍、狀態(tài)健康、無(wú)污染、傳代次數低的細胞進(jìn)行轉染。