復旦團隊復活冰封18個(gè)月的人腦，三體要成真了？

隨著(zhù)類(lèi)器官技術(shù)的進(jìn)步，腦類(lèi)器官在研究人類(lèi)大腦發(fā)育、腦疾病建模和開(kāi)發(fā)新藥方面顯示出巨大的潛力，腦類(lèi)器官對于研究和模擬人類(lèi)神經(jīng)系統疾病至關(guān)重要。然而，腦類(lèi)器官的培養周期長(cháng)，成本高，極大限制了它們在生物醫學(xué)研究中的應用。攜帶病理特征的新鮮人腦組織是研究神經(jīng)系統疾病更為可靠的模型。目前，具有特定病理特征的腦組織可獲取性，可操縱性以及低溫保存神經(jīng)活性都面臨很多技術(shù)難題。冷凍保存技術(shù)已在胚胎干細胞、配子、胚胎、膠質(zhì)母細胞瘤類(lèi)器官、子宮內膜器官等方面廣泛應用，極大助力再生醫學(xué)的發(fā)展。腦類(lèi)器官/腦組織是由多種神經(jīng)細胞構成的復雜結構，具有神經(jīng)功能網(wǎng)絡(luò )活動(dòng)，二維細胞和非神經(jīng)類(lèi)器官的冷凍方法不適用于神經(jīng)類(lèi)器官和人腦組織。因此，迫切低需要開(kāi)發(fā)腦類(lèi)器官/腦組織的低溫保存方法，對推動(dòng)腦科學(xué)基礎和臨床轉化研究具有十分重要的意義。

2024年5月13號，復旦大學(xué)腦科學(xué)轉化研究院邵志成研究員團隊在Cell Reports Methods雜志在線(xiàn)發(fā)表了題為【Effective cryopreservation of human brain tissue and neural organoids】的研究論文，報道了一種被稱(chēng)為 MEDY 的全新腦類(lèi)器官冷凍保存新技術(shù)，該技術(shù)在冷凍過(guò)程中能夠保留腦類(lèi)器官的復雜結構和功能活性，保留人腦組織的病理特征。MEDY將能夠大規模、可靠地存儲各種神經(jīng)類(lèi)器官和腦組織，促進(jìn)多種神經(jīng)類(lèi)器官在基礎研究、臨床應用和藥物篩選中的廣泛應用，對將來(lái)真正實(shí)現完整人腦的冷凍保存起到一定的推動(dòng)作用。

研究團隊首先選擇了多種在維持類(lèi)器官形態(tài)完整性、減少神經(jīng)元死亡和保護軸突生長(cháng)過(guò)程中起作用的試劑，包括甲基纖維素（Methylcellulose）、乙二醇（Ethylene glycol）、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、海藻糖（Trehalose）、葡萄糖（Glucose）、蔗糖（Sucrose）和脯氨酸（Proline）等，通過(guò)不同濃度梯度，初步篩選出對類(lèi)器官有一定保護作用的試劑甲基纖維素、乙二醇和 PVP 作為低溫保存介質(zhì)組分的候選試劑。為了進(jìn)一步提高冷凍保存的效率，研究團隊測試了不同冷凍保存介質(zhì)組合并添加 ROCK 抑制劑 Y27632 后對類(lèi)器官的凍存保護效果進(jìn)行檢測，結果表明 4 種組合冷凍劑都極顯著(zhù)地解決了類(lèi)器官復蘇后出現大量碎片的問(wèn)題。通過(guò)對復蘇后類(lèi)器官軸突生長(cháng)狀態(tài)、神經(jīng)元生長(cháng)狀態(tài)以及凋亡比例的對比分析，最終確定了 1% 甲基纖維素+10% 乙二醇+10% DMSO+10 μM Y27632（MEDY）作為腦類(lèi)器官的最佳冷凍保存劑。

進(jìn)一步，通過(guò)改進(jìn)復溫流程，以及復蘇后ROCK抑制劑預處理步驟，最終建立了腦類(lèi)器官凍存復蘇新方法。改進(jìn)方法復蘇后的神經(jīng)類(lèi)器官保留了細胞多樣性、細胞組織結構以及神經(jīng)元功能活性。

研究團隊首先選擇了多種在維持類(lèi)器官形態(tài)完整性、減少神經(jīng)元死亡和保護軸突生長(cháng)過(guò)程中起作用的試劑，包括甲基纖維素（Methylcellulose）、乙二醇（Ethylene glycol）、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、海藻糖（Trehalose）、葡萄糖（Glucose）、蔗糖（Sucrose）和脯氨酸（Proline）等，通過(guò)不同濃度梯度，初步篩選出對類(lèi)器官有一定保護作用的試劑甲基纖維素、乙二醇和 PVP 作為低溫保存介質(zhì)組分的候選試劑。為了進(jìn)一步提高冷凍保存的效率，研究團隊測試了不同冷凍保存介質(zhì)組合并添加 ROCK 抑制劑 Y27632 后對類(lèi)器官的凍存保護效果進(jìn)行檢測，結果表明 4 種組合冷凍劑都極顯著(zhù)地解決了類(lèi)器官復蘇后出現大量碎片的問(wèn)題。通過(guò)對復蘇后類(lèi)器官軸突生長(cháng)狀態(tài)、神經(jīng)元生長(cháng)狀態(tài)以及凋亡比例的對比分析，最終確定了 1% 甲基纖維素+10% 乙二醇+10% DMSO+10 μM Y27632（MEDY）作為腦類(lèi)器官的最佳冷凍保存劑。

進(jìn)一步，通過(guò)改進(jìn)復溫流程，以及復蘇后ROCK抑制劑處理步驟，最終建立了腦類(lèi)器官凍存復蘇新方法。改進(jìn)方法復蘇后的神經(jīng)類(lèi)器官保留了細胞多樣性、細胞組織結構以及神經(jīng)元功能活性。

然后，研究團隊將長(cháng)期培養的大尺度腦類(lèi)器官進(jìn)行 MEDY 冷凍復蘇，發(fā)現其對成熟的類(lèi)器官依然起到冷凍保護作用。此外，該 MEDY 技術(shù)可以更廣泛地應用于多種腦區域特異性類(lèi)器官，包括背/腹側腦、脊髓、視神經(jīng)類(lèi)器官和癲癇患者源性腦類(lèi)器官。同時(shí)，MEDY 可用于 3D 人腦組織的低溫保存，解凍后仍可保留其病理特征。最后，研究團隊通過(guò)轉錄組學(xué)分析發(fā)現，MEDY 通過(guò)抑制內質(zhì)網(wǎng)介導的細胞凋亡途徑從而保護突觸功能，實(shí)現在低溫狀態(tài)下對腦類(lèi)器官的保護作用。

綜上所述，該研究能夠在將來(lái)顯著(zhù)減少了神經(jīng)類(lèi)器官的制備時(shí)間和成本，并能維持活體人腦組織的病理特征，便于各種神經(jīng)類(lèi)器官和活體腦組織的大規模存儲，促進(jìn)腦科學(xué)基礎研究、神經(jīng)類(lèi)移植器官治療和藥物評估與篩選。

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