原位雜交實(shí)驗流程

原位雜交組織（或細胞）化學(xué)簡(jiǎn)稱(chēng)原位雜交，屬于固相分子雜交的范疇，它是用標記的DNA或RNA為探針，在原位檢測組織細胞內特定核酸序列的方法。

一、合成RNA探針

1、設計探針引物

RNA探針長(cháng)度500bp最為合適。一輪引物不添加啟動(dòng)子序列，二輪引物在正向引物的5端加上T7啟動(dòng)子序列，在反向引物的5端加上SP6啟動(dòng)子序列。

2、探針合成

用未添加啟動(dòng)子序列的引物克隆出探針序列的DNA模板，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳驗證。膠回收，將其連接到T載體上，轉化涂板，進(jìn)行質(zhì)粒提取送測。用添加了T7和SP6啟動(dòng)子序列的引物再次給探針序列兩端添加上啟動(dòng)子序列。取一輪以質(zhì)粒為模板擴增PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖進(jìn)行PCR擴增，凝膠電泳驗證，若條帶單一明亮，膠回收PCR產(chǎn)物用于后續體外轉錄。

3、體外轉錄

利用PCR擴增出的帶有啟動(dòng)子序列探針的DNA模板，分別用相應的RNA聚合酶進(jìn)行體外轉錄，得到單鏈RNA探針。探針包括正義探針和反義探針，用正義探針(T7RNA 聚合酶轉錄得到)進(jìn)行的原位雜交實(shí)驗作為陰性對照組，用反義探針(SP6RNA聚合酶轉錄得到)進(jìn)行的原位雜交實(shí)驗為實(shí)驗組。體外轉錄體系如下:

混勻后37，孵育2小時(shí)。

4.質(zhì)量檢測、中止消化

轉錄結束后，取1ul轉錄產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳驗證，電泳條帶明亮不彌散則進(jìn)行下一步。驗證后，每管加入2DNase，37消化15min，去除DNA模板。加入2uL0.2MEDTA(pH8.0)終止消化反應。

5.沉降洗滌保存

每管用DEPC水補至100uL，加入2倍體積的的無(wú)水乙醇和1/10體積的的3M乙酸鈉，置于-80℃沉降過(guò)夜/-20℃沉降30分鐘。將沉降后的體系放入離心機中，4℃，12000rpm離心15分鐘，棄除上清。加入100uL70%無(wú)水乙醇浸洗，4℃，12000rpm離心15分鐘，棄除上清，在超凈臺風(fēng)干。將沉淀的RNA探針加入DEPC水溶解，使其濃度為10ng/uL，分裝后放入-80℃保存備用。

注意事項：

（1）DEPC 即二乙基焦碳酸酯（diethylprocarbonate），可滅活各種蛋白質(zhì)，是 RNA 酶的強抑制劑。原位雜交在各步處理中，所有液體試劑都應經(jīng) DEPC 處理。

（2）含有 Tris緩沖液的溶液中，不能加入 DEPC。

（3）原位雜交引物用同一個(gè)遺傳背景的個(gè)體克隆全長(cháng)測序成功，在測序成功的全長(cháng)序列上設計引物，保證特異性。

二、雜交

1、準備工作

①圓形細胞爬片在濃鹽酸中浸泡過(guò)夜，經(jīng)超純水沖洗后，浸泡在無(wú)水乙醇中；②將圓形細胞爬片、玻璃培養皿、金屬鑷子180℃高溫烘4h去除RNase；③取出后靜置1h冷卻，培養皿中加入0.1mg/ml多聚賴(lài)氨酸處理。④正、反面各避光浸泡15min；⑤ 用鑷子依次夾取玻片，迅速蘸取DEPC水，正面朝上放在錫箔紙折起的褶皺上，37℃放置3h備用。

2、組織包埋與切片

原位雜交實(shí)驗組織石蠟包埋，將包埋好的蠟塊從-20℃取出，刀片、臺面、切片機等用RNase抑制劑噴霧噴灑擦凈，修整好的蠟塊固定于切片機上，切片厚度設置為5μm，將蠟帶在43℃ DEPC水中水浴展開(kāi)，用多聚賴(lài)氨酸處理過(guò)的圓形玻片撈取蠟帶，置于錫箔紙褶皺上37℃烘干過(guò)夜。

3、脫蠟與復水

鑷子夾取圓形玻片依次于下述玻璃培養皿中：二甲苯Ⅰ、Ⅱ各6min脫蠟→二甲苯：乙醇（1:1） 6min→無(wú)水乙醇Ⅰ、Ⅱ各6min→85%乙醇→70%乙醇→50%乙醇→ 30%乙醇各 4min梯度復水。

4、預雜交

①鑷子夾取圓形玻片至24孔板中，每孔加入500μl DEPC水洗滌4min；②加500μl PBST（1×PBS+0.1%Tween-20)洗滌10min，洗2次；③加300μl 2μg/ml蛋白酶K，37℃消化12min；④加500μl 0.1M TEA孵育10min；⑤加500μl PBST 10min，洗滌兩次；⑥加500μl 4%的多聚甲醛，避光固定20min；⑦加500μl PBST，10min，洗滌兩次；⑧加300μl HB雜交液，60℃預雜交4h。

HB雜交液的配制：

HB現用現配，本次實(shí)驗一次配制3份。

5、探針變性與雜交

將200ng探針加入到30μl HB雜交液中，95℃變性5 min，迅速置于冰上冷卻，然后加入到270μl已60℃預熱的裝有HB雜交液中1.5ml 無(wú)酶管中，充分混勻后加入到樣品孔中，60℃雜交17h。

6、洗脫探針

洗脫探針所用試劑均需37℃/60℃預熱，并在相應環(huán)境中洗脫。

洗脫探針條件

7、封閉、抗體孵育

①向樣品孔加入500μl MaNaT(0.1 M maleic acid, 0.15 M NaCl, 0.1% Tween-20, pH 7.5) 避光洗滌10min，洗滌兩次。②加入300μl Blocking bufferr（1% Blocking reagent, 0.1 M MaNaT, 0.15 M NaCl, 0.1% Tween-20）避光封閉1.5h。③按照1：3000比例將Anti-Digoxigenin-AP (anti-DIG-AP; Roche Applied Science)抗體加入到Blocking buffer中，充分混勻后吸取 300μl 加入樣品孔，避光孵育 1h。

8、洗滌抗體

向樣品孔加入500μl MaNaT洗滌抗體,避光洗滌5min重復2遍，再加入500μl MaNaT洗滌抗體，避光洗滌15min重復4遍。

9、顯色及終止反應

吸出 MaNaT，加入 500μl AP Buffer (5.844 μg/ml NaCl, 12.114 μg/ml Tris, 10.1 μg/ml MaCl·6H2O, pH 9.5)洗滌兩次，每次5min；按1:50的比例將 NBT/BCIP (nitro blue tetrazolium/5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate)加入 AP Buffer 中，充分混勻后吸取 400μl 加入樣品孔，避光顯色10min，鏡檢觀(guān)察到藍紫色信號時(shí)，吸出顯色液。

10、復染

吸出 PBST，加入 500μl 4%多聚甲醛固定 40min；吸出固定液，加入 500μl PBST 洗滌兩次，每次 10 min；吸出 PBST，加入 300μl 1%中性紅染液復染。

11、封片

復染后，用鑷子夾取玻片，依次在梯度乙醇(70%, 95%, 100%, 100%)中脫水；在 100%無(wú)水乙醇：二甲苯(1:1)中處理浸泡2min；在二甲苯中浸泡5 min；最終以中性樹(shù)膠封片。

12、顯微觀(guān)察

使用 1 至 4 倍放大倍數觀(guān)察組織雜交整體信號表達情況，使用 10 倍、20 倍及 40 倍放大倍數觀(guān)察局部雜交信號，拍照。

A, B:斑馬魚(yú)中某基因正義RNA探針信號分布；

C, D: 斑馬魚(yú)中某基因反義RNA探針信號分布。

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