如何提高DNA濃度/純度測定的準確性？

分子生物學(xué)實(shí)驗中經(jīng)常需要對樣品進(jìn)行濃度和純度的測定，它相當于一種質(zhì)控，以此來(lái)確保下游實(shí)驗的結果可靠。

常用的DNA濃度/純度測定設備是紫外分光光度計，它的原理是利用物質(zhì)分子對紫外可見(jiàn)光譜區的輻射吸收來(lái)進(jìn)行分析物質(zhì)成分。

這樣來(lái)描述可能有點(diǎn)生硬，我們舉個(gè)栗子：

假設現在有一樣物質(zhì)A，它溶解在溶液內，當光照射溶液時(shí)，溶液內的A會(huì )吸收一部分的光。不同顏色的光有不同的波長(cháng)，A對不同顏色的光（不同波長(cháng)）的吸收程度是不一樣的。

雙鏈的DNA，它能對波長(cháng)為260nm的光進(jìn)行強烈的吸收，吸收的程度可以用一個(gè)叫吸光度的數值來(lái)測量，濃度越高的DNA，理論上吸光度也越高。

最后，通過(guò)與標準品的吸光度數值對比后，就可以知道未知濃度的DNA有多少量了。

DNA濃度測定通常會(huì )使用紫外分光光度計，常見(jiàn)的有NanoDrop這類(lèi)設備。除了DNA，它還能測定RNA和蛋白的吸光度。

要提高濃度測定的準確性，需要注意以下幾點(diǎn)：

• 檢測之前，務(wù)必充分混勻DNA溶液，因為這類(lèi)機器的上樣檢測體積只需要1-2uL，如果樣品沒(méi)有混勻，那么每次檢測樣品濃度也會(huì )不一樣。

• 因為上樣體積很小，所以樣品很容易揮發(fā)，如果把樣品加在檢測基座后不馬上檢測的話(huà)，會(huì )導致測出來(lái)的樣品濃度偏高。

• 實(shí)驗環(huán)境和耗材的穩定性要高。檢測設備應該在放置在溫度可控、通風(fēng)的環(huán)境下；裝樣品的管子如果不是要進(jìn)行吸取樣品操作的話(huà)，需要時(shí)刻緊閉。

• 每次檢測完畢，都需要對檢測基座或者比色皿進(jìn)行清洗和擦拭，確保不會(huì )有樣品殘留后，再進(jìn)行下一次上樣檢測。

• 空白調零，應該使用溶解待檢測樣品的溶液來(lái)調零。例如如果用水溶解DNA，那就用水調零，用其他緩沖液溶解，則用對應的緩沖液調零。

在測定后，我們通常會(huì )看到，設備會(huì )提供幾個(gè)不同的結果給我們，有的是數值，例如OD230、OD260，有的是比值，例如OD260:280，那這些結果代表什么呢？

OD是optical density(光密度)的縮寫(xiě),表示被檢測物吸收的光密度。

OD=lg(1/trans)，其中trans為被測物質(zhì)的透光值。

不同的OD以及OD比值，代表不同的意義：

【OD230】

提取核酸時(shí)會(huì )用到各種化合物，它們以鹽離子的形式存在，例如胍鹽、苯氧基離子、硫氰酸酯。

這些鹽離子對230nm波長(cháng)的紫外光有強烈的吸收值。如果測定核酸時(shí)，發(fā)現OD230數值很高，代表溶液中的鹽離子濃度很高。

【OD260】

雙鏈DNA在這個(gè)波長(cháng)下會(huì )對光有強烈的吸收。

【OD280】

芳香族氨基酸在這個(gè)波長(cháng)下，有強烈的光吸收。如果該數值很高，代表DNA溶液中可能存在蛋白質(zhì)的污染.

【OD320】

通常是由光散射造成的。如果該數值很高，意味著(zhù)溶液內有顆粒物污染、待檢器皿例如比色皿有污漬。

【OD260:OD280】

通常用于判斷DNA或RNA溶液的純度。常用的指標是：在OD230數值較低，OD320數值較低的前提下。較高純度的DNA，比值應該為1.7～1.9之間，較高純度的RNA，比值應該為1.9～2.0之間。

當然，以上測定的結果并非是絕對計數的數值，它是一個(gè)參考數值，因為我們在測定時(shí)是不涉及用到標準品這樣東西，所以，也就是我們測出來(lái)的數可以作為一定程度的參考。

而且，當一些外界因素影響時(shí)，測定也會(huì )出現偏差，例如樣本含量非常非常低時(shí)，測定的數值誤差就會(huì )很高并不具參考意義，設備耗材出現問(wèn)題時(shí)，測定的數值也會(huì )不準。

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