克隆形成實(shí)驗的原理及實(shí)驗步驟

一、背景介紹

克隆形成實(shí)驗是研究細胞存活率并探討單個(gè)細胞增殖潛能的有效方法之一。即在體外培養環(huán)境下，通過(guò)使單個(gè)細胞經(jīng)過(guò)連續分裂增殖至少6代，形成的細胞集群被稱(chēng)為克隆或集落。每個(gè)克隆的尺寸通常在0.3-1.0mm之間，含有50個(gè)以上的細胞。通過(guò)計算克隆形成率，能夠對單個(gè)細胞的增殖潛力進(jìn)行量化分析。

用途：

（1）評估細胞增殖能力：克隆形成實(shí)驗可以幫助研究人員評估細胞的增殖潛力。通過(guò)觀(guān)察和計數形成的獨立克隆，可以了解細胞在體外環(huán)境中的增殖速率和能力。

(2)研究細胞群體依賴(lài)性：克隆形成實(shí)驗有助于了解細胞的群體依賴(lài)性，即細胞是否需要相互合作形成克隆。這對于理解細胞群體內的相互作用和細胞信號傳導至關(guān)重要。

(3)篩選藥物和治療方案：克隆形成實(shí)驗可用于評估藥物對細胞增殖的影響。通過(guò)在實(shí)驗前后比較克隆形成率，研究人員可以評估潛在藥物或治療方案的療效。

常用的手段有兩個(gè)：

①平板克隆形成實(shí)驗：通過(guò)將細胞培養于培養基中，主要適用于貼壁生長(cháng)的細胞，以評估細胞的克隆形成能力。

②軟瓊脂克隆形成實(shí)驗：通過(guò)將細胞懸浮于含瓊脂糖的培養基中，主要用于評估貼壁和懸浮的腫瘤細胞或轉化細胞系的克隆形成潛能。

二、平板克隆形成實(shí)驗的實(shí)驗步驟

(1) 從細胞處于對數生長(cháng)期狀態(tài)開(kāi)始，通過(guò)胰酶消化將細胞懸浮于血清培養基中，并進(jìn)行準確計數；

(2) 在每個(gè)實(shí)驗組中，控制細胞數量在400-1,000個(gè)細胞/孔的范圍內（對于不同的細胞類(lèi)型，需要進(jìn)行預實(shí)驗以確定最佳細胞數量），并接種于6孔板；

(3) 持續培養至14天，或直到大多數單個(gè)克隆中的細胞數超過(guò)50個(gè)。在培養過(guò)程中，每隔3天更換培養基，并觀(guān)察細胞狀態(tài)；

(4) 克隆形成完成后，使用1 mL 4%多聚甲醛進(jìn)行細胞固定，固定時(shí)間為15-30分鐘。最后，用PBS洗滌；

(5) 向每個(gè)孔中加入1 mL結晶紫染液，染色時(shí)間控制在10-20分鐘內；

(6) 利用PBS進(jìn)行多次細胞洗滌，進(jìn)行拍照（分別對整個(gè)六孔板及每個(gè)孔進(jìn)行單獨拍照）。

注意：本實(shí)驗的成功關(guān)鍵在于細胞懸液的制備和適度的接種密度，務(wù)必確保細胞均勻分散，防止細胞團的形成，并謹慎確保接種密度不過(guò)于密集。

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