CHO細胞培養技術(shù)經(jīng)驗分享

簡(jiǎn)介：
CHO細胞（Chinese hamster ovary cell，CHO）一個(gè)轉化細胞系，1957年從中國倉鼠卵巢細胞得到。CHO細胞目前是現代制藥企業(yè)進(jìn)行研發(fā)、生產(chǎn)生物治療藥物 (單抗、酶、激酶和激素等) 中常用的非人類(lèi)哺乳動(dòng)物細胞系。

原理：
培養基無(wú)特殊要求，可有多種選擇,一般用DMEM（高糖）培養基+10%胎牛血清+2%雙抗。置于37℃,5%CO2的培養箱培養。每隔48h換液，或當培養基呈現熒光黃色及時(shí)換液，否則細胞會(huì )出現大規模脫落和變形死亡。

當單層培養細胞匯合達90%以后(兩天左右)，棄去培養基，用2ml不含鈣、鎂離子的PBS潤洗2次，用0.5mlPBS+0.5ml 含0.25%ETDA的胰蛋白酶消化1-2min（在培養箱放30s-1min），鏡下觀(guān)察變圓或輕輕擊打培養皿側壁發(fā)現有細胞團塊脫落或皿底花斑狀，用1ml（血清）細胞培養基終止消化，九宮格法吹落細胞收集到離心管，以800-1000rpm，室溫離心5min。

以1:2~1:3的比例傳代，離心棄去廢液，用2ml~3ml（血清）細胞培養基充分重懸細胞沉淀成單個(gè)細胞，以“Z"字打入含有7ml培養基的10cm皿中，輕柔十字晃勻不超過(guò)十下并靜置數分鐘后鏡下觀(guān)察，平穩放入培養箱中。

凍存液的配置為血清：二甲基亞砜(DMSO)=9:1。取長(cháng)勢良好，匯合度達90%并無(wú)污染的細胞，消化離心后用凍存液1.5ml重懸后轉移至凍存管中，標記好細胞種類(lèi)、日期、姓名，放入恢復室溫的梯度凍存盒，一同放置于-80°C冰箱。

準備好離心管中放入3ml（血清）細胞培養基，并確保水浴鍋打開(kāi)并達到37℃，從-80℃冰箱取出目標凍存管，放入密封袋并在水浴鍋中迅速搖晃解凍<1min，與3mL培養基混合均勻。在800 rpm，離心5分鐘，棄去上清液，用新培養基重懸細胞為單個(gè)細胞狀態(tài)，加入10cm皿中，培養過(guò)夜。第二天換液并檢查細胞密度。

注意事項：

1.CHO細胞對損傷不易耐受，請注意密切觀(guān)察。

2.不同胰酶消化速度有差別，根據經(jīng)驗調整用量和用時(shí)。

3.細胞傳代用PBS洗的目的是去除舊培養基中血清對胰酶的抑制作用。

4.不要將細胞中液體吸凈后放置過(guò)久，細胞變干后死亡。

5.細胞消化所用胰酶的最適工作溫度大約在37攝氏度左右，故放入培養箱更好的促進(jìn)胰酶消化。

6.細胞凍存及復蘇的基本原則是慢凍快融，才能最大限度的保存細胞活力。（細胞保護劑（DMSO）能提高細胞膜對水的通透性，緩慢冷凍可使細胞內的水分滲出細胞外，減少細胞內冰晶形成造成的細胞損傷。復蘇時(shí)快速融化，避免由于緩慢融化使細胞外結晶的水分滲入細胞內形成胞內再結晶對細胞造成損傷）。

7.細胞凍存嚴格遵循梯度降溫，不可直接放入低溫冰箱，如果沒(méi)有梯度凍存盒，可以4℃ 10-30min，-20℃ 30-1h，-80℃過(guò)夜。

8.復蘇后第二天換液是為了去除殘留凍存液對細胞的傷害。

9.細胞量少或凍存過(guò)久的細胞復蘇到中皿中，等長(cháng)滿(mǎn)后傳代到大皿中。

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