大腸桿菌質(zhì)粒DNA的提取

一、試劑配制

1. LB液體培養基。

2. 100 mg/ml氨芐西林儲存液：稱(chēng)取25g的氨芐西林粉末，加去離子水至250ml，全部溶解后過(guò)濾、分裝，20℃保存。

3. 溶液Ⅰ：50 mmol/L葡萄糖溶液，25 mmoi/L Tris-鹽酸（pH 8.0），10 mmol/L EDTA（pH 8 0）。1 mol/L Tris-鹽酸（pH 8.0）12.5ml，0 5 mol/L EDTA（pH8.0）10ml，葡萄糖4.730g；加去離子水至500ml，高壓滅菌，貯存于4℃。

4. 溶液Ⅱ：0.2moI/L 氫氧化鈉溶液，1％ SDS（10 N 氫氧化鈉20 μl，10％SDS 100μl，加去離子水至1ml），使用前臨時(shí)配制。

5. 溶液Ⅲ（pH 4.8）：5 mol/L 醋酸鉀300ml，冰醋酸57.5ml，加去離子水至500ml，4℃保存。

6. 苯酚：氯仿（1：1，V／V）（酚和氯仿均有很強的腐蝕性操作時(shí)應戴手套?。?。

7. 無(wú)水乙醇。

8. 70％乙醇。

9. RNase A（20 mg/ml）溶液：100 mg RNA酶干粉加5ml超純水溶解，然后在沸水煮

15min，分裝，20℃保存。

10. TE緩沖液：10 mmol/L Tris-鹽酸（pH8.0），1 mmol/L EDTA（pH8.O）。

二、實(shí)驗方法

1. 挑取LB固體培養基上生長(cháng)的單菌落，接種于2.0ml LB（含Amp 100 μg/ml）液體培養

基中。37℃、250 r/min振蕩培養過(guò)夜（約12——14h）。

2. 取1.5ml細菌培養液倒入離心管中，4℃、6000轉離心30s，棄上清，將離心管倒置于紙巾上，去除殘留液體。

3. 菌體沉淀重懸于100μl用冰預冷的溶液Ⅰ中，劇烈振蕩，使菌體分散混勻，室溫下放置5 min。

4. 加入200μl新配制的溶液Ⅱ，蓋緊管口，快速溫和顛倒離心管5——10次，以混勻內容

物，冰浴5min。

5. 加入150μl預冷的溶液Ⅲ，蓋緊管口，溫和顛倒5——10次混勻，冰浴3——5min，4℃、6000轉離心5min。轉移上清到一個(gè)新的1.5ml Ep管中。

6. 加入等體積的酚一氯仿抽提劑，振蕩混勻，4℃、6000轉，離心2 rain。

7. 小心移出上清于1.5ml Ep管中；加入2倍體積用冰預冷的無(wú)水乙醇于室溫沉淀雙鏈

DNA，混勻，室溫放置2--5rain，4℃、6000轉離心5min。

8. 棄上清，將離心管倒置于紙巾上使所有液體流出，加入1ml 70％乙醇，蓋緊離心管顛倒數次，4℃、6000轉，離心2min。

9. 去除所有的乙醇溶液，將管倒置于紙巾上使液體流盡，室溫干燥5——10min，直到乙醇都揮發(fā)干凈。

10.將質(zhì)粒DNA沉淀溶于50 μl TE緩沖液（含20 μg/ml RNaseA）中，溫和振蕩數秒，-20℃儲存備用。

2. 加入SDS后則要注意不能過(guò)分用力振蕩，溫和混勻，但又必須讓它反應充分。

3. 加入溶液Ⅱ混勻之后，一定要在冰上放置，不要搖動(dòng)，對于溶液Ⅲ同樣處理。