原代角質(zhì)形成細胞的分離培養方法

原代細胞在相關(guān)細胞實(shí)驗使用過(guò)程中越來(lái)越多，人們不再單單趨于使用細胞系進(jìn)行實(shí)驗研究，因為細胞系常常由于體外長(cháng)期培養，而容易丟失原有的生物學(xué)特性，對藥物處理的反應差距越來(lái)越大。

原代細胞剛從組織中分離開(kāi)，生物學(xué)特性未發(fā)生很大變化，仍保留原來(lái)的遺傳特性，也*為接近和反應體內生長(cháng)特性，原代細胞的活力和生長(cháng)狀態(tài)都比較好，細胞的純度和基因保留可達到90%以上，適宜用于藥物敏感性試驗、細胞分化等試驗研究，使用原代細胞進(jìn)行實(shí)驗，可以獲得更準確的研究和數據。

角質(zhì)形成細胞是一種不斷分化的復層鱗狀上皮細胞，其分化的最終階是形成角蛋白。根據角質(zhì)形成細胞的發(fā)展階段和特點(diǎn)，從內向外可將其分為五層?；准毎麑佑址Q(chēng)生發(fā)層，棘細胞層，顆粒層，透明層，角質(zhì)層。

角質(zhì)形成細胞的分化成熟表現為從基底層到向角質(zhì)層的逐漸移行。在單一移行過(guò)程中，角質(zhì)形成;細胞的形狀和功能也逐漸發(fā)生著(zhù)變化，從單層柱狀上皮的基底層到扁平的細胞核消失的角質(zhì)層。

新生的基底細胞進(jìn)入棘細胞層，然后上移到顆粒層的最上層。細胞組織來(lái)源于實(shí)驗動(dòng)物的正常皮膚組織，細胞生長(cháng)狀態(tài)為貼壁培養。

1.培養基1：iCell原代角質(zhì)細胞培養體系

4.基礎培養基：DMEM/F12

5.緩沖液：無(wú)菌不含Ca2+和Mg2+的1×PBS+1×P/S，pH=7.4

6.消化液1：1.2U/ml的dispase Ⅱ

7.消化液2：0.25%胰蛋白酶+0.02mM EDTA

8.消化液3：0.1%Ⅰ型膠原酶

9.75%醫用酒精

10.胎牛血清（FBS）

1.培養皿

2.T-25細胞培養瓶

3.100目不銹鋼網(wǎng)篩

4.200目不銹鋼網(wǎng)篩

5.眼科剪

6.眼科鑷

7.離心管（15ml、50ml）

1.新鮮的包皮組織，裝盛于含有無(wú)菌生理鹽水或1×PBS的無(wú)菌容器中，于保溫盒中，冰上放置離體6h內運輸到實(shí)驗室進(jìn)行后續分離。

2.在無(wú)菌環(huán)境中取出包皮組織，用1×PBS清洗2-3次去除表面血液后，75%的酒精浸泡100s

3.酒精浸泡組織后快速將組織轉入裝有1×PBS的培養皿中震蕩清洗數次以去除酒精，然后用眼科剪小心剪去皮下組織（脂肪，微血管等）

4.將去除了脂肪和微血管組織的再用1×PBS清洗幾次后，剪成3mm*8mm左右的皮片，用消化液1  4度消化過(guò)夜（15-18h）。

5.第二天，用2個(gè)眼科鑷子小心撕開(kāi)過(guò)夜消化的皮膚組織，分離真皮和表皮；

6.分離的表皮用眼科剪剪碎后用消化液3 37度水浴消化1h。

7.消化完成后用移液器充分吹打100次左右，然后用含血清的培養基終止消化，過(guò)200目不銹鋼網(wǎng)篩后取濾懸液，轉入15ml離心管中，400g離心10分鐘，離心完成后棄去上清，沉淀用3ml的1×PBS吹打重懸后，400g離心5min離心完成后棄去上清，沉淀用2ml的原代角質(zhì)細胞培養基吹打重懸后，轉入已經(jīng)裝有2ml培養基的T-25培養瓶中，將培養瓶置于37℃的二氧化碳培養箱中培養。

8.視細胞貼壁情況48-72h后換液去除未貼壁的細胞，之后繼續培養，視細胞生長(cháng)狀況和培養基顏色每2-3d換液一次；待細胞貼壁率達到80-90%后，進(jìn)行常規傳代擴增操作（角質(zhì)細胞對胰酶不太敏感，消化時(shí)間可能會(huì )增加到10-15分鐘，有時(shí)需要配合使用無(wú)菌細胞刮鏟進(jìn)行傳代）。