原代細胞培養

原理

鼠胚原代培養是原代培養一個(gè)類(lèi)型，是指從孕鼠中剖取適宜胎齡的胎鼠，從特定組織中分離出細胞，在適宜條件下增殖培養，直到它們占據所有可用的基質(zhì)（即達到匯合狀態(tài)）的培養階段。在此階段，必須通過(guò)將細胞轉移到含有新鮮生長(cháng)培養基的新容器中進(jìn)行繼代培養（即傳代），以為其提供更多的繼續生長(cháng)空間。

用途

1、藥物篩選實(shí)驗；
2、信號通路與機制研究；
3、生物制品的生產(chǎn)(如制備單克隆抗體）等 

材料與儀器

【儀器設備】超凈工作臺、濾器、CO2 培養箱、電熱干燥箱

【器械及器皿】培養瓶、培養皿、滴管、鑷子、手術(shù)剪

【試劑】:常用培養基還有：DMEM-高糖、DMEM-低糖、DMEM/F12、RPM1640、MEM、M-199等，可根據培養需求合理選擇。

血清:一般常用為胎牛血清，人血清和其它動(dòng)物血清。

平衡鹽溶液:主要用于作為稀釋和灌注的液體,維持細胞滲透壓，提供緩沖系統，使培養液的酸堿度維持在培養細胞生理范圍內，提供細胞正常代謝所需的水分和無(wú)機離子等。常用的有PBS，Hank's 等。

抗生素:常用為青霉素和鏈霉素。

其它添加成分:緩沖系統，常用為HEPES，在 20 度時(shí)為 7.55；37 度為7.31; HEPES 不是起維持 PH 恒定的作用，而是起恒定和抵抗快速 PH 變化的，所以調整 PH 常常用 NaHCO3 溶液。

有機補充物,如丙酮酸鈉，谷氨酰胺等。促細胞分裂因子，如生長(cháng)因子類(lèi)的 FGF、EDF。貼璧和鋪展因子，如膠原蛋白，纖粘蛋白等。

懷孕的母鼠、多聚賴(lài)氨酸、0.25% 胰酶、70-75% 酒精溶液

步驟

1、胚鼠原代培養：

1.1 實(shí)驗前，超凈工作臺或生物安全柜紫外燈提前照射 30 分鐘；

1.2 取材:取懷孕母鼠，頸椎脫臼法處死后，整個(gè)鼠體浸入盛有純酒精的燒杯中浸泡 1 分鐘。取出母鼠在不銹鋼手術(shù)盤(pán)中用無(wú)菌手術(shù)剪打開(kāi)腹腔，取出鼠胚，放入無(wú)菌培養皿內。注意取材可在無(wú)菌操作臺外操作。

1.3 用 70-75% 酒精擦拭裝有鼠胚的培養皿外周后，將培養皿移至超凈工作臺或生物安全柜中，用含雙抗 Hanks 液洗滌鼠胚數遍卻除血污。在體視顯微鏡下進(jìn)行操作，用無(wú)菌手術(shù)器械去除多余組織，用解剖鑷剖取需要的組織，移入含解離液或培養基的 50 ml 離心管中，用眼科剪將組織剪碎成1立方毫米的肉糜狀；

1.4 在含組織的 50 ml 離心管中加入解離液或培養基至 10 ml。首先用 10 ml彎頭滴管對組織進(jìn)行吹打 5-10 次，然后用 1 ml 槍頭的吹打組織，最后用 200 μl 的尖的一端進(jìn)行吹打；

1.5 將上述組織懸液通過(guò) 70 μm 過(guò)濾器過(guò)濾切碎和分散的組織懸浮液，然后 l200 rpm， 4℃ 離 10 分鐘；

1.6 棄掉上清，加入配置好的細胞培養基重懸細胞，接種于經(jīng)多聚賴(lài)氨酸預處理的培養瓶或培養板中，將其置于于 37℃、5% CO2 培養箱中，三天后換液，以后每?jì)商鞊Q細胞培養液；

2、傳代培養

2.1 實(shí)驗前，超凈工作臺或生物安全柜紫外燈提前照射 30 min，開(kāi)始實(shí)驗時(shí)，酒精擦拭消毒雙手；

2.2 將原代培養的培養瓶倒置顯微鏡下觀(guān)察細胞形態(tài)，確定細胞是否需要傳代培養；

2.3 用酒精棉球擦凈操作臺，點(diǎn)燃酒精燈，將培養瓶口灼燒消毒；

2.4 倒掉培養瓶中的舊培養基，留下貼壁生長(cháng)的細胞；

2.5 在培養瓶中加入適量 0.25 % 胰酶至剛好漫過(guò)貼壁生長(cháng)的細胞即可，擰上瓶蓋，將培養瓶置于37℃的培養箱中 5 min。在此期間，如果在顯微鏡下觀(guān)察可以看到細胞收回突起變成圓形。

2.6 取出培養瓶,輕輕搖晃培養瓶或吹打使細胞脫離瓶壁，將細胞懸液移至離心管中，4℃、800 rpm離心 5 min；

2.7 棄掉離心管中的上清，加入細胞培養基重懸細胞植于多聚賴(lài)氨酸預處理的培養瓶或培養板，再將其置于37℃、5% CO2培養箱中培養，此時(shí)細胞可以繼續分裂而傳代。

注意事項

1、原代培養注意事項：

1）原代培養要重點(diǎn)注意無(wú)菌操作，所用器械需提前高壓滅菌；

2）因為鼠胚原代培養時(shí)，獲取組織較少，建議在冷光源體視顯微鏡下操作；

3）原代細胞培養過(guò)程比較慢,培養時(shí)間最少需要一周以上的時(shí)間。若 2 天后可能會(huì )出現培養基變黃的現象,且無(wú)漂浮物,排除污染，屬于正?，F象,這是因為細胞在貼壁生長(cháng)過(guò)程中釋放了CO2 和其他物質(zhì)導致培養液 PH 發(fā)生了改變,所以變黃；

4）正常貼壁細胞在培養幾天后,會(huì )逐漸貼滿(mǎn)整個(gè)瓶底或者皿底,呈現出相應的形狀,有的呈纖維狀,有的星多邊形；

5）細胞的第一次傳代,一定要密度高一些傳代原代細胞傳代密度低,很難長(cháng)起來(lái)。建議 1:2-13傳代如果細胞數量夠的條件下,P2-P3 代完成實(shí)驗是最合適的。如果細胞數量不夠,那細胞的提取和培養比較重要,盡可能地讓細胞的好狀態(tài)多維持幾代對實(shí)驗成敗來(lái)說(shuō)至關(guān)重要；

6）原代細胞不建議凍存,因為凍存很容易復活不成功。如果要凍存的話(huà),建議在 P2或P3 代凍存,一些比較難復蘇的細胞可以適當提高凍存液中的血清濃度；

7）很多原代細胞的體外培養需要加入生長(cháng)因子,細胞才能正常的生長(cháng)增殖和分化；

2、細胞傳代注意事項：

1）細胞離心時(shí)離心速度建議800-1000 rpm/min，4℃ 離心 5 分鐘，避免轉數過(guò)高，造成細胞破碎死亡；

2）消化時(shí)，注意觀(guān)察，切勿消化過(guò)度；

常見(jiàn)問(wèn)題

1、當在顯微鏡下觀(guān)察細胞形態(tài)時(shí)發(fā)現，多數細胞已經(jīng)失去分裂能力了，而好的細胞應該呈現長(cháng)梭形，立體感強。因此，這些細胞不能用于傳代細胞的培養。

2、理論上，在顯微鏡下可以觀(guān)察到梭形的細胞說(shuō)明傳代培養成功。和原代培養的觀(guān)察類(lèi)似。但是總的來(lái)說(shuō)，我們實(shí)驗室的實(shí)驗結果不是很好，觀(guān)察到的好的細胞很少。其原因可能和原代培養時(shí)候的相近。

3.對于不能進(jìn)行傳代培養的細胞我們進(jìn)行了活性的觀(guān)察實(shí)驗。

用臺盼藍染液染色，取 9 滴細胞液加 1 滴臺盼藍，染色不超過(guò) 3 分鐘，在顯微鏡下觀(guān)察可以發(fā)現，有的細胞核被染成藍色，而有的細胞核沒(méi)有著(zhù)色。

這是因為細胞核被染色的細胞是死細胞，而未被染色的則是活細胞,通過(guò)這個(gè)實(shí)驗可以計算視野中細胞的存活率。

4、細胞增殖分化緩慢：有些原代細胞體外培養需要加入生長(cháng)因子，細胞才可正常增殖和分化，因而，實(shí)驗前要根據具體細胞配置相應培養基；

5、細胞污染：細胞污染類(lèi)型分為：物理污染、化學(xué)污染以及生物污染，因而原代培養要嚴格無(wú)菌操作，培養基專(zhuān)用專(zhuān)配不要交叉使用；

6、消化時(shí)，細胞長(cháng)時(shí)間難以消化下來(lái)：胰酶使用前，需要在 37℃ 水浴鍋充分預熱，已達到最佳酶活性；