細胞侵襲實(shí)驗全步驟解析

用BD公司的Matrigel 1:8或者根據細胞產(chǎn)生mmp的量來(lái)決定稀釋,包被Transwell小室底部膜的上室面,置37℃30min使Matrigel聚合成凝膠。使用前進(jìn)行基底膜水化。

制備細胞懸液前可先用基礎培養基加1%的血清培養細胞，讓細胞饑餓12-24h,進(jìn)一步去除血清的影響。

消化細胞,終止消化后離心棄去培養液,(用PBS洗1-2遍),用含0.1%的BSA的無(wú)血清培養基重懸及調整密度，通常調整細胞密度至5×10^5cells/ml。

取細胞懸液100μl加入Transwell上室,　也可以根據細胞生長(cháng)速度進(jìn)行調整，操作小提示：接種劑量不同的細胞，其侵襲能力是不同的，細胞量過(guò)多，穿過(guò)膜的細胞會(huì )過(guò)多過(guò)快，最后會(huì )難以統計結果;而細胞量過(guò)少，可能還沒(méi)到檢測的時(shí)間點(diǎn)，所有的細胞都已穿過(guò)，進(jìn)入下室。因此最少也要保證在收樣的時(shí)候，上室內還要有一定量的細胞存在。

24孔板下室一般加入600μl含生長(cháng)因子或血清的*培養基,特別注意的是,下層培養液和小室間常會(huì )有氣泡產(chǎn)生,一旦產(chǎn)生氣泡,下層培養液的趨化作用就會(huì )減弱甚至消失,種板時(shí)一旦出現氣泡,要將小室提起去除完氣泡,再將小室放進(jìn)培養板。若是平行孔，一般設置兩組.

培養細胞:常規培養12-48h(主要依細胞侵襲能力而定)。24h較常見(jiàn),時(shí)間節點(diǎn)的設置除了要考慮到細胞的侵襲力外,處理因素以及細胞數目的影響也不可忽視。

采用直接計數法,取出Transwell小室,棄去孔中培養液,用無(wú)鈣的PBS洗2遍,甲醇固定30分鐘,將小室適當風(fēng)干。

 0.1%結晶紫染色20 min,用棉簽輕輕擦掉上層未遷移細胞,注意不要蹭到已穿膜的那一層細胞，之后再用PBS洗3遍。

400倍顯微鏡下每個(gè)樣本取6-10個(gè)視野觀(guān)察細胞計數，取平均值，統計分析。