科研小白入門(mén)必修之MTT實(shí)驗操作總結

1.接種細胞：用含10％胎小牛血清得培養液配成單個(gè)細胞懸液，以每孔1000－10000個(gè)細胞接種到96孔板，每孔體積180ul-200ul.

2.培養細胞：同一般培養條件，正常培養2-3天也可根據試驗目的和要求決定培養時(shí)間。

3.顯色：每孔加MTT溶液（5mg/ml用PBS 配)20ul.繼續孵育4小時(shí)，終止培養，小心吸棄孔內培養上清液，對于懸浮細胞需要離心后再吸棄孔內培養上清液。每孔加150ul DMSO，振蕩10分鐘，使結晶物充分融解。

4.比色：選擇480nm-570nm波長(cháng)，在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定各孔光吸收值，記錄結果，以時(shí)間為橫坐標，吸光值為縱坐標繪制細胞生長(cháng)曲線(xiàn)。

以時(shí)間為橫軸，光吸收值為縱軸繪制細胞生長(cháng)曲線(xiàn)或計算細胞生長(cháng)抑制率、細胞相對增殖率等。

1.細胞消化。若消化出現問(wèn)題，則會(huì )影響細胞的活性，進(jìn)而影響 OD 值。對于 MCF-7、BT474等一系列容易消化的細胞，消化時(shí)胰蛋白酶中不添加 EDTA，只需胰酶浸潤數秒即可。然而，對于caco-2等一系列難以消化的細胞，胰蛋白酶中可添加濃度為 0.25% 的 EDTA。

2.選擇適當得細胞接種濃度。

3. 結晶物的溶解。加入 DMSO 溶解后，將加入DMSO的96孔板放入37℃ 孵箱內孵育 10～20 min，這樣有助于 DMSO對紫色結晶物的溶解（尤其在冬天）。

4..避免血清干擾：一般選小于10％的胎牛血清的培養液進(jìn)行試驗。在顯色后盡量吸盡孔內殘余培養液，棄去培養液時(shí)，吸取的時(shí)候要注意移液頭要緊貼孔內側壁吸取，不要觸碰底部的紫色結晶；或者將96孔板倒扣于濾紙上來(lái)吸取孔內的培養液。

5.設空白對照：與試驗平行不加細胞只加培養液的空白對照。其他試驗步驟保持一致，最后比色以空白調零。每組設定3復孔。

6.MTT粉末和溶液保存時(shí)都需要避光，用鋁箔紙包好就可以。

7.酶聯(lián)免疫檢測儀使用前應打開(kāi)電源預熱半小時(shí)。

8.選擇不同的波長(cháng)，酶聯(lián)免疫檢測儀檢測靈敏度不同。應根據實(shí)驗目的選擇相應的波長(cháng)。