銷(xiāo)售熱線(xiàn)
                              
                19126518388
            
                              
        
                              
      
                              
      
                              
      
             
         
    
         
         

  
  
  
                              
    
                              
	  
                              
        
        
                              
 
                              
     
   
 
                               
         
                              
	   
                              
    
                              
  
                              
      

                              
  
                              
    
                                
      
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                                技術(shù)文章ARTICLE
                                
            
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                                純化的RNA的點(diǎn)雜交和狹線(xiàn)雜交
                                
                
                                
                  發(fā)布時(shí)間： 2021-12-21　　點(diǎn)擊次數： 797次  
                
                                
                
                                
                 
                                原理
                                點(diǎn)雜交和狹線(xiàn)雜交技術(shù)（Kafatos et al. 1979) 用于在同一固相支持物（通常為帶電荷的尼龍膜）上固定幾種核酸樣品，然后用合適的探針與已固定的樣品雜交，并由此判斷靶序列的濃度。通過(guò)估計樣品點(diǎn)發(fā)射出 的信號的強度，與已知濃度的標準品信號強度 進(jìn)行比較，確定待測樣品中靶序列的量。
                                材料與儀器
                                RNA 檢測樣品、標準品和陰性對照 探針標記與變性
                                NaOH 預雜交液 RNA 變性液 SSC
                                印跡裝置 絞鏈儀 帶正電荷尼龍膜 厚印透紙 水浴鍋
                                步驟
                                一、材料

                                1. 緩沖液與溶液

                                NaOH ( 10 mol/L)

                                預雜交液

                                RNA 變性液

                                0.1X SSC ( 含 0.1% SDS，m/V)

                                0.1X SSC ( 含 1%SDS，m/V)

                                0.5X SSC ( 含 0.1% SDS，m/V)

                                1X SSC ( 含 0.1% SDS，m/V)

                                2X SSC

                                20X SSC

                                2. 核酸與寡聚核甘酸

                                RNA 檢測樣品、標準品和陰性對照

                                3. 探針

                                探針標記與變性

                                4. 專(zhuān)用設備

                                印跡裝置

                                絞鏈儀（如 Stratalinker, Stratagene; GS Gene Linker, Bio-rad) 或真空爐、微波爐

                                帶正電荷尼龍膜

                                厚印透紙（如 Whatman 3 MM, Schleicher&Schuell GB004, 或 Sigma QuickDraw)

                                預熱水浴鍋到 68℃

                                二、方法

                                安裝印跡裝置

                                1. 切一張合適大小的帶正電荷尼龍膜。用鉛筆標上表示方向的記號。用水把膜簡(jiǎn)單弄濕，在 20X SSC 中室溫泡 1 h。

                                2. 在膜浸泡期間，先用 0.1 mol/L NaOH 小心清洗印跡裝置，再用無(wú)菌水洗干凈。

                                3. 把兩片厚濾紙用 20X SSC 浸濕，再放到真空器頂部。

                                4. 把樣品槽插入裝置的上部，把濕尼龍膜放在樣品槽加樣孔的底部，用吸管在膜的表面滾動(dòng)以去除膜與裝置夾層中的氣泡。

                                5. 加緊夾板，連接真空管。

                                6. 加入 10X SSC 直至液面沒(méi)過(guò)尼龍膜，關(guān)掉真空，再用 10X SSC 充滿(mǎn)。

                                RNA 樣品準備

                                7. 把每個(gè) RNA 樣品（溶解在 10 μl 水）分別與 30 μl RNA 變性液混合。

                                8. 65℃ 溫育 5 min，然后在冰上冷卻。

                                9. 向每個(gè)樣品中加入等體積 20X SSC。

                                10. 輕輕向印跡裝置中吸入 10XSSC，直到淹沒(méi)尼龍膜。

                                RNA 樣品的印跡和 RNA 在膜上的固定

                                11. 把所有樣品輕輕加入狹線(xiàn)中，然后輕輕吸干膜。當所有樣品都鋪到膜上后，每個(gè)狹線(xiàn)用 1 ml 10XSSC 洗兩次。

                                12. 當第二次洗膜完成后，繼續輕輕吸干膜。

                                13. 取下膜，然后用紫外交聯(lián)、烘烤或微波照射把 RNA 固定在膜上。

                                固定化 RNA 的雜交與洗膜

                                14. 把膜放入烤盤(pán)或雜交爐中，加入 10~20 ml 預雜交液 68℃ 溫育 2 h。

                                15. 把已變性的放射性標記的探針直接加到預雜交液中。在適當的溫度下繼續溫育 12~16 h。

                                16. 雜交完后從塑料袋中取出膜，然后盡可能快地把膜轉移到室溫下裝有 100~200 mJ、1X SSC ( 0.1% SDS) 的塑料容器中。蓋緊塑料容器，放到搖床上輕搖 10 min。

                                17. 把膜轉移到另一個(gè)裝有 100~200 ml 的、預熱到 68℃ 的 0.5X SSC ( 含 0.1% SDS) 的塑料袋中，然后在此溫度下輕搖 10 min。

                                18. 按步驟 17 重復洗膜兩次，使總的洗膜次數達到三次。

                                19. 用濾紙吸干膜，在 -70℃ 條件下放射自顯影 24~48 h ( Kodak XAR-5 或相當的膠片)。鎢酸鹽型的增感屏比舊式稀土型的效果更好。當然，磷光成像儀也可以用來(lái)成像。
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