變性聚丙烯酰胺凝膠的制備實(shí)驗

步驟

材料

緩沖液和溶液

參照附錄 1 配制貯存液、緩沖液、試劑。稀釋貯存液到適當的濃度。

丙烯酰胺溶液（45%m/V）
丙烯酰胺（DNA 測序級）                          434 g
N,N'-亞甲雙丙烯酰胺                                  16 g
加水                                                            至 600 ml

加熱至 37°C 以促進(jìn)溶解用蒸餾水調至 1 升，用硝酸纖維素膜過(guò)濾（孔徑 0.45ptn). 室溫貯存于棕色瓶中。另外一種較為昂貴的方法是購買(mǎi)預先混合好的丙烯酰胺: 雙丙烯酰胺粉末，再用水溶解。便宜的丙烯酰胺: 雙丙烯酰胺粉末通?；旌嫌薪饘匐x子。由此配置的貯存液需要純化，方法是，與 0.2體積的樹(shù)脂（MB-1,Mallinckrodt) 混合攪拌，再用 Whatmenl 號紙過(guò)濾。貯存中，丙烯酰胺: 雙丙烯酰胺會(huì )緩慢的變成酸性，這個(gè)脫氮基過(guò)程由光和堿催化。保持溶液 pH 值在7.0 或者以下，在黑色瓶中保存于室溫應該每幾周重配一次。

過(guò)硫酸銨水溶液（1.6%m/V)

去離子水

去污劑

乙醇

KOH/甲醇溶液
在 100ml 甲醇中加入 5 gK0 H 配成，用于清洗玻璃板，貯存在密閉的玻璃瓶中。

聚硅氧烷溶液
傳統的聚硅氧烷溶液中包括二氯二甲基硅，它有毒性、揮發(fā)性并且易燃。近年來(lái)，出現了一些無(wú)毒的替代物，包括 Gel Slick(FMC Bioproducts)、RainX(Unelko，Scottsdale Arizona), 和 Acrylease(Stratagene)。

10XTBE 電泳緩沖液
TBE 在聚丙烯酰胺凝膠電泳時(shí)的濃度是 lx(89 mmol/L Tris-硼酸，2 mmol/L EDTA)，這一濃度是瓊脂糖電泳用量的 2 倍（請見(jiàn)第 5 章）。用于聚丙烯酰胺凝膠電泳的垂直電泳槽的緩沖液池一般較小，故所通過(guò)的電流量通常相當大。要用 lxTBE 才能夠保證適當的緩沖容量。緩沖液的 pH 值應接近8.3。一般無(wú)須調 pH 值；可是，對于每次新配的 10XTBE 電泳緩沖液都要認真檢査 pH 值。
使用同樣的 10xTBE 電泳緩沖液配制膠和工作緩沖液，因為兩者之間微小的差異也會(huì )導致 DNA遷移時(shí)嚴重扭曲。
使用氨基乙磺酸（36 g/L 的 10XTTE 緩沖液） 取代標準 TBE 溶液中的硼酸可以減少由于形成甘油-硼酸陰離子脂類(lèi)化合物而導致的在膠的頂部的條帶扭曲<Pisa-Willanson and Fuller1992)。若需要更多的信息請參見(jiàn) DNA 測序反應中的甘油一節。

TEMED(N,N，N',N'-四甲基乙二胺）
電泳級的 TEMED 在很多公司有售（Sigma,Bio-Rad),TEMED 容易吸潮，必須 4°C 貯存在密閉的瓶中。它是聚合反應中的連接催化劑。

尿素，固體

特殊裝置

彈簧夾：5 cm 長(cháng)，每塊膠 5 到 7 個(gè)。

干膠架
雖然不重要，干膠架對于干燥和貯存測序用的玻璃平板是非常方便的（Bio Whitraker)。

封膠帶
例如 3M Scotch Stretchable Tape(Lab Safety Supply,Janesville，Wisconsin)，3M Scotch yellow electrical tape#56(Life Technologies),3M Scotch polytetrafluorethylene(PFTE)extruded film tape。關(guān)于不同種膠帶的用法和其他封膠的方法，參見(jiàn) Hengen(1996)。

膠板（配對的） 和隔板
制膠的板一塊比另一塊略長(cháng) 3.5-4.0 cm, 或者有一塊板是缺刻的。為避免膠板裂了或者漏了，最好保持板是配對的并且和測序膠的槽相對應。

手套
無(wú)滑石粉、易處理的橡膠或者聚氯乙烯（PVC)。

凡士林
可選擇，見(jiàn)步驟 4

保護性的工作合紙
一面是塑料的（Kaydry Lab Cover from Fisher) 或者 Benchkote。

鯊魚(yú)齒梳子
0.4 mm 厚,32,64 或 96 齒. 依賴(lài)電泳裝置的能力。

有臂的燒瓶（250 ml)

隔板（厚度一致或者邊緣較窄）
每膠兩板，由有彈性的薄塑料板（0.4 mm) 或特氟?。⊿anger and Coulson 1978） 制成，使玻璃板隔開(kāi)。在膠板和隔板之間形成不透水的封口，使未凝固的膠溶液不會(huì )漏出。
邊緣窄的隔板用于制造底部比頂部厚的膠，使底部的條帶比較窄并且整塊膠的條帶比較均勻。雖然它有這樣的優(yōu)點(diǎn)，但是比較難以制備和干燥。

注射器（60cc)
可選擇，見(jiàn)步驟 15.

試管架

55°C 水浴

方法

重要：為防止皮膚油脂的污染. 必須一直帶無(wú)滑石粉的手套，并且只能拿板的邊沿。

準備膠板

1. 必要時(shí)，甩 KOH/甲醇清洗板上的舊污漬。

2. 然后用溫的去污劑溶液洗滌玻璃板和間隔片，用自來(lái)水*沖洗，再用去離于水洗凈。用乙醇沖洗玻璃板去掉水印，并放于一旁晾干。
必須小心翼翼地洗凈玻璃板. 以確保灌膠時(shí)不會(huì )產(chǎn)生氣泡。

3. 小塊玻璃板的內面用聚硅氧烷溶液處理。在化學(xué)通風(fēng)櫥內將玻璃板放在一疊紙巾上, 內表面向上，在上面傾倒少量硅烷化液。用幾張 Kimwipes 紙在玻璃板表面將硅烷化液涂布均勻，讓玻璃板風(fēng)干（l~2 min）。然后用去離子水洗，再用乙醇洗，風(fēng)干。

4. 把大塊玻璃板（干凈面朝上）放在空的試管架上，把隔片放在玻璃板的兩邊（見(jiàn)圖12-9)。
如果用邊沿窄的隔片，把厚的一邊放在板的底部。在大板和隔片之間加入小滴凡士林使隔片在下一步時(shí)不會(huì )移動(dòng)。

5. 再將較?。ɑ驇О伎冢┑牟ＡО逶陂g隔片上放置妥當，對齊隔片。

6. 用若干個(gè)大彈簧夾（長(cháng) 5 cm) 將玻璃板的一邊夾起來(lái)。
在玻璃板另一邊及玻璃板底部貼上凝膠密封帶，形成不透水密封，必須特別注意玻璃板的底角，因為這是最容易發(fā)生滲漏的地方。

7. 將彈簧夾換到已封好的一邊，在玻璃板的另一邊貼上凝膠密封帶。

8. 將梳子放在膠模的敞開(kāi)端并檢査是杏貼切適合，取出梳子將空膠模放在實(shí)驗桌上。



配膠

9. 在實(shí)驗桌的工作區上鋪上襯塑料的保護紙。
灌制測序凝膠時(shí)幾乎不可能避免將丙烯酰胺溶液滴于桌面。

10. 在一個(gè) 250 ml 有臂錐形瓶中配制適當濃度的丙烯酰胺溶液（表 12-19)。這些溶液足夠配制一塊 40 cmx40 cm 的測序凝膠。
注意：凝膠的配制必須一氣呵成，中間不能斷斷續續。

11. 混合所有試劑，在 55°C 水浴中加熱 3 min 幫助尿素溶解。
溶解尿素的過(guò)程十分緩慢，必須依靠外部的熱量。大約的體積是 66 ml, 加水到 100 ml。

12. 從水浴中取出溶液，冷卻 15 min 至室溫。不斷攪拌混合物。

13. 把燒瓶放在真空裝置里抽去氣體。
防止聚合時(shí)產(chǎn)生氣泡。

14. 把溶液放入 250 ml 玻璃燒杯中。加 3.3 ml 新制的 16% 的過(guò)硫酸銨，混勻。
舊的硫酸銨沒(méi)有足夠的聚合能力，會(huì )產(chǎn)生模糊的條帶。



15. 加 50ulTEMED，輕輕旋動(dòng)容器以混勻溶液。直接配膠?；蛘哂?60cc 注射器吸取上述溶液約 40 ml。注意，不要有氣泡。
與蛋白電泳相比，已經(jīng)使用了最大量的 TEMED，確保了聚合足夠快和足夠均勻。聚合速度與時(shí)間有關(guān), 溫度越低聚合越慢。有經(jīng)驗的人利甩預冷卻的方法可以用一次配制的混合物制成多塊 40 cmx40 cm 膠。
從此步開(kāi)始，動(dòng)作盡可能迅速。

16. 用手托住膠模使之與水平面大約成 45°角，沿一邊從移液管中緩緩灌入溶液（參見(jiàn)圖 12-9)。



17. 將模子放在試管架上（見(jiàn)圖 12-9)。
這一位置減少了模子底部的水壓，防止漏膠。

18. 立即將鯊魚(yú)齒梳子的平整側插入凝膠液約 0.5 cm 處，梳子兩端插人液面的深度應當等同，以便使凝膠垂直放置時(shí)梳子的平整表面能夠保持水平。
如果梳子旁邊可見(jiàn)氣泡，慢慢取出梳于。洗凈梳子表面，重新插入膠中。

19. 用彈簧夾夾住梳子使之就位。將剩余的丙烯酰胺-尿素溶液沿凝膠頂部加入，形成一串丙烯酰胺液滴。讓凝膠在室溫下聚合 15 min。

20. 沖洗 60cc 注射器以免被聚合的丙烯酰胺所堵塞。
警告：沖洗時(shí)將釋放出少量未聚合的丙烯酰胺，應戴手套。

21. 聚合 15 min 后對凝膠進(jìn)行檢査，觀(guān)察是否恰恰在梳子平整表面之下出現一道折射率不同的 Schlieren 線(xiàn)，這道線(xiàn)是聚合理想的標志。聚合完畢后（大約 1 小時(shí)），取下彈簧夾。
警告：沖洗時(shí)將釋放出少量未聚合的丙烯酰胺，應戴手套。

22. 聚合完畢后，凝膠可立即使用（見(jiàn)方案 11)，或保存于室溫達 24 小時(shí)，或保存于4°C 48 小時(shí)。為防止保存期間發(fā)生脫水，可將梳子留于凝膠內并在凝膠頂部圍放一些用 1XTBE 濕潤的紙巾，紙巾可用 Saran 包裝膜覆蓋。在這一階段不要拔掉梳子。