CAT活性的層析分析法

材料與儀器

DNA
PBS 乙酸乙酯 氯仿 甲醇 Tris·Cl
薄層層析缸 濾紙 離心管 離心機

步驟

1.  100 mm 培養皿中的轉染了CAT表達質(zhì)粒的貼壁細胞，用PBS洗兩次，每次5 ml每培養皿加入1 ml TEN溶液。將細胞置于冰浴5 min。

 

2.  用橡膠細胞刮子將細胞從培養皿上刮下來(lái)，將其轉入一只1.5 ml 的微量離心管中，置于冰浴5 min。

3.  在4℃以最大離心速度離心細狍1 min，細胞沉淀重懸于100 μl 冰冷的0.25 mol/l 的pH7.5的Tris·Cl緩沖液中。

4.  在干冰/乙醇中凍結細胞5 min，移至37℃融解5 min。重復這種凍融過(guò)程兩次以上。

5.  在冰上冷卻細胞裂解液，然后，4℃以最大離心速度離心5 min。移出并保留上清（細胞提取物），置于- 20℃凍存。

 

6.  在下面混合液中分析20 μl 細胞提取液

2 μl  200 μCi/ml ［14C］氯霉素
20 μl  4 mmol/l 乙酰輔酶A
32.5 μl  1 mol/l Tris·Cl，pH7.5
75.5 μl  H2O

 

7.  對于每組分析，在微量離心管中加130 μl 上述混含液和20 μl 提取液，輕輕混勻。 37℃溫育1 h。

 

8.  加1 ml 乙酸乙酯至反應液中，在漩渦混合器上混勻。離心1 min，移出上層液相（乙酸乙酯）在Speedvac蒸發(fā)器中蒸干乙酸乙酯45 min。

9.  薄層層析缸的平衡：在缸中加入190 ml 氯仿，10 ml 甲醇，及一張與TLC薄層平板大小大致相等的Whatman 3MM 濾紙，靜置2  h。

10.  將毎個(gè)樣品重懸于30 μl 乙酸乙酯中，點(diǎn)樣，在TLC薄板邊緣之上約2 cm 處，每樣5 μl。

 

11.  在盛有200 ml 19：1氯仿/甲醇的平衡過(guò)的層析缸中展開(kāi)色譜，進(jìn)行2 h 或至溶劑的前沿接近薄板的頂部為止。取下TLC薄板，在空氣中晾干。用放射性墨水筆作上標記后，用塑料薄膜包裹，置于感光片上進(jìn)行放射自顯影。

12.  切出各顯影點(diǎn)相應的薄層塊放入閃爍液中計數，先測定出各單乙酰氯霉索的計數值所占的百分數而計算提取物的活性，按下列公式計算的活性：

  

同實(shí)驗其他方法

原位裂解細胞的CAT分析法

1.  60 mm 培養皿中轉染了CAT表達質(zhì)粒的細胞，用2 ml PBS洗1次。每培養皿加入2 ml 低滲緩沖液，在室溫下溫育2~5 min。 2.  吸去低滲緩沖液，加入400 μl T

CAT活性的相-抽提分析法

一、來(lái)源于哺乳動(dòng)物細胞 1.  按“CAT活性的層析分析法"中的步驟1~5的凍融法，制備哺乳動(dòng)物細胞提取物。如果用胰蛋白酶消化或制細胞方法來(lái)收集細胞，則將原位裂解法的步驟1至4用以下的步驟2

人生長(cháng)激素的放射免疫分析法

1.  取轉染了hGH表達質(zhì)粒的哺乳動(dòng)物細胞的培養液100~500 μl。 2.  加100 μl 培養液或標準品至12 mm×75 mm 圓底試管中。加入100 μl 125I-

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