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THP-1細胞培養秘籍給有需要的您

發(fā)布時(shí)間： 2021-12-02　　點(diǎn)擊次數： 2844次

THP-1細胞系是1980年Tsuchiya等人建立的人單核細胞白血病細胞系。它來(lái)自一位急性單核細胞白血病患者的血液，有分化為多種巨噬細胞的能力，是各領(lǐng)域研究常用的細胞系之一。

THP-1細胞基本信息

細胞名稱(chēng)	THP-1 (人單核細胞白血病)
細胞別稱(chēng)	THP1; THP 1; THPI; THP-1; Tohoku Hospital Pediatrics-1
種屬	人
組織來(lái)源	急性單核細胞白血病，單核細胞
生長(cháng)特性	懸浮細胞
細胞形態(tài)	單核細胞
生長(cháng)培養基	RPMI-1640＋10% FBS＋0.05mM β-mercaptoethanol＋1% P/S
培養環(huán)境	氣相：95%空氣；5%CO₂ 溫度：37℃
推薦傳代比例	1：2-1：4
凍存液配方	90%FBS+10%DMSO

THP-1細胞的特點(diǎn)

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喜歡酸性環(huán)境

在偏酸性環(huán)境中，THP-1生長(cháng)更快，所以當培養基稍微變黃（呈橘紅色）時(shí)，是適合細胞生長(cháng)的，此時(shí)補液或半換液即可。（詳細操作見(jiàn)下文換液篇）

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有密度依賴(lài)性

THP-1細胞密度低時(shí)，生長(cháng)較慢，培養密度維持在50萬(wàn)-100萬(wàn)細胞/毫升為宜；超過(guò)200萬(wàn)/毫升則需要傳代。

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對血清要求高

選擇品質(zhì)好的血清更有利于THP-1細胞生長(cháng)。

▲ THP-1生長(cháng)圖片

培養攻略之收貨篇

常溫細胞

收到細胞后，放進(jìn)培養箱靜置2-4小時(shí)，之后將瓶中培養基全部離心（1200rpm或250g，3分鐘），去上清，用適量新鮮培養基重懸細胞，按比例接種到新培養瓶中。

凍存細胞

收到細胞后，如果不復蘇，放進(jìn)-80℃冰箱暫存或放進(jìn)液氮長(cháng)期保存。如果復蘇，按照常規復蘇步驟操作（見(jiàn)下文復蘇篇）即可。

小貼士：由于THP-1有密度依賴(lài)，將培養瓶豎著(zhù)放進(jìn)培養箱（瓶蓋朝上），可以增加細胞局部密度，從而促進(jìn)細胞生長(cháng)，注意瓶蓋要保持透氣。

▲ 常溫THP-1細胞，收貨處理示意圖

培養攻略之換液篇

補液法

培養基變黃時(shí)可補加適量（1~2mL）新鮮培養基，補加1-2次之后，用離心的方式全部換液，離心1200rpm （約250g）3分鐘。

半換液法

以T25瓶子為例，瓶子里裝有5mL培養基。豎起瓶子靜置一段時(shí)間，待細胞沉底，小心吸出2.5mL的培養基，轉移到離心管，離心1200rpm （約250g）3分鐘，檢查有沒(méi)有沉淀，以免損失細胞；原瓶補充2.5mL新鮮培養基，離心管里若有細胞，則用新鮮培養基重懸后放回原瓶。

小貼士：如果換液后第二天培養基就變得很黃，同時(shí)鏡下檢查未污染，說(shuō)明細胞密度大，該傳代了。

▲ 半換液操作示意圖

培養攻略之傳代篇

直接分瓶法

搖晃培養瓶，把細胞搖勻，均分到兩個(gè)瓶子里，每瓶再補充等量培養基。

離心法

離心后計數，按照40-50萬(wàn)細胞/mL的密度接種到T25瓶里，瓶中培養基量以5mL為宜。不方便計數時(shí)，按1:2比例傳代。

小貼士：細胞碎片較多的情況下，建議用離心法傳代，離心轉速可適當降低（推薦800~1000rpm或160~200g）。

▲ 傳代時(shí)機

培養攻略之凍存篇

凍存步驟

1. 預先配制好凍存液

2. 細胞1200rpm（約250g）3分鐘離心后

3. 去上清，用配好的凍存液重懸細胞

4. 轉移入凍存管

5. 凍存管放進(jìn)程序凍存盒

6. 凍存盒放進(jìn)-80度冰箱過(guò)夜，再放液氮長(cháng)期保存

小貼士：

1. 由于THP-1是懸浮細胞，更易受到凍存影響，建議加大凍存密度，大約200萬(wàn)-300萬(wàn)/mL為宜，以提高復蘇存活率。

2. 沒(méi)有程序降溫盒的同學(xué)，可以選擇非程序凍存液（使用前咨詢(xún)試劑商是否適用于THP-1，并做凍存測試），或者按照【4℃ 20min→-20℃ 30min→-80℃ 過(guò)夜→液氮保存】的順序手動(dòng)梯度降溫。

培養攻略之復蘇篇

復蘇步驟

1. 預熱水浴鍋至37℃

2. 準備一個(gè)15mL離心管，加入2-3mL左右*培養基待用

3. 將細胞從-80℃冰箱或液氮中取出后，放進(jìn)一次性PE手套中，立即投入水浴鍋，迅速用力搖晃管子，使其1分鐘內融化

4. 酒精擦拭凍存管，進(jìn)入生物安全柜，把融化的細胞懸液緩慢滴加到步驟2準備好的離心管中

5. 1200rpm（約250g）離心3分鐘

6. 同時(shí)準備1個(gè)新的T25培養瓶，加入5mL*培養基

7. 去上清，新鮮培養基重懸細胞后滴加到步驟6培養瓶里，放入培養箱

小貼士：THP-1細胞復蘇后通常需要3-5天恢復狀態(tài)，建議復蘇后48小時(shí)內不要進(jìn)行操作。

常見(jiàn)問(wèn)題及解決方案

N.1

收貨時(shí)細胞出現偽足，或是碎片較多怎么辦？

受到運輸影響，懸浮細胞會(huì )短暫性出現形態(tài)改變的現象，如偽足等。通過(guò)傳代培養，1周左右可以恢復正常。一些細胞在運輸途中死亡而產(chǎn)生碎片，通過(guò)傳代離心可以去除（見(jiàn)上文傳代篇）。

NO.2

培養過(guò)程中細胞發(fā)生貼壁怎么辦？

少量細胞貼壁屬于正常情況，將細胞懸液轉移至新瓶中即可。當貼壁細胞的比例高于20%，說(shuō)明細胞生長(cháng)環(huán)境有異常，需排查培養箱設置、培養基成分，以及培養器皿是否異常。

NO.3

培養過(guò)程中細胞發(fā)生聚團怎么辦？

少量細胞聚團，呈葡萄串狀，屬于正?，F象，特別是細胞密度較低時(shí)，易出現這種情況。更換血清品牌或增大血清比例（不超過(guò)20%）有助于解決聚團問(wèn)題。不建議將聚團的細胞吹散，等待密度高時(shí)，會(huì )自己分散開(kāi)。

NO.4

培養基里一定要加β-巰基乙醇嗎？

β-巰基乙醇是一種常用的培養補充劑，有抗氧化的作用，可減少氧化應激對THP-1細胞的影響。當細胞密度過(guò)大但需要維持時(shí)，可適當增加巰基乙醇的比例（不超過(guò)標準量的1.5倍）。

NO.5

鏡下觀(guān)察時(shí)，難以聚焦或估算密度怎么辦？

懸浮細胞會(huì )隨著(zhù)液體流動(dòng)，不容易聚焦，靜置5-10分鐘使細胞沉底，之后再輕輕放上顯微鏡觀(guān)察，將有助于聚焦和估算細胞密度。

▲ 嚴重聚團的THP-1細胞

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