我的siRNA怎么了？

這一期，我們來(lái)說(shuō)一下siRNA轉染和干擾效果不佳的問(wèn)題。

要保證RNA干擾的效果就必須保證siRNA能夠成功的轉染到細胞中去，那有時(shí)候會(huì )轉染不進(jìn)去，原因可能有如下幾點(diǎn)：

1、轉染方法：轉染siRNA濃度太低。FAM驗證轉染效率時(shí)siRNA(FAM)的量的終濃度是50-150nM都可以，需要根據細胞進(jìn)行摸索。lipo-2000的量和使用的siRNA量成比例的，一般用1:1的效果好一些。

建議用24孔板摸索條件。siRNA 所加的量及其濃度可以根據實(shí)驗自己調整，按照要求配成20uM的濃度，那1ul就是20pmol,在1ml細胞培養液中加1ul,那終濃度就是20nM,加2ul就是40nM，以此類(lèi)推。24孔板摸濃度后，用6孔板時(shí)把轉染體系相應放大即可。

實(shí)驗中需要注意細胞狀態(tài)要好，代數不要大，細胞密度適中，50%左右（根據的細胞生長(cháng)情況調節），鋪板時(shí)要鋪均勻，添加轉染復合物時(shí)要小心滴加。轉染時(shí)建議不要使用雙抗和血清，雙抗轉染時(shí)對細胞有毒性，會(huì )導致細胞狀態(tài)不好，血清會(huì )降低轉染效率。

2、轉染試劑：轉染實(shí)驗前應根據實(shí)驗要求和細胞特性選擇適合的轉染試劑。每種轉染試劑都會(huì )提供一些已經(jīng)成功轉染的細胞株列表和文獻，通過(guò)這些資料可選擇較為適合實(shí)驗設計的轉染試劑?？赡芗毎麑IP2000不是太敏感，如果是這樣，建議更換其他的轉染試劑

3、細胞原因：

a、和細胞狀態(tài)、細胞代數、細胞密度等有關(guān)，一般低的細胞代數（<50）能確?；蛐筒蛔?。較為適合轉染的細胞是經(jīng)過(guò)幾次傳代后達到指數生長(cháng)期的細胞，細胞生長(cháng)旺盛，最容易轉染。細胞培養在實(shí)驗室中保存數月和數年后會(huì )經(jīng)歷突變，總染色體重組或基因調控變化等而演化。這會(huì )導致和轉染相關(guān)的細胞行為的變化。也就是說(shuō)同一種系的細胞株，在各實(shí)驗室不同培養條件下，其生物學(xué)性狀發(fā)生不同程度的改變，導致其轉染特性也發(fā)生變化。因此，如果發(fā)現轉染效率降低，可以試著(zhù)轉染新鮮培養的細胞以恢復最佳結果

b、有的細胞不太好轉染，比如懸浮、干細胞、原代等，可查找相關(guān)文獻，看別人做這種細胞時(shí)用的什么方式。如果細胞不好轉，就要考慮換一種方式進(jìn)行您的實(shí)驗了，比如說(shuō)用病毒、電轉等。

轉染前列腺癌細胞后拍的圖片，轉染進(jìn)去的整個(gè)細胞是綠色的，可以清晰的看到細胞形態(tài)，沒(méi)有轉染進(jìn)去的就是綠色的小點(diǎn)兒。

如果通過(guò)上邊的問(wèn)題驗證到siRNA的確是可以轉染進(jìn)細胞，但干擾效果又不理想的話(huà)那么可能的原因來(lái)了：

1、轉染效率問(wèn)題，如果少量siRNA進(jìn)入細胞，作用于基因后，有時(shí)候細胞會(huì )有補償機制，表達量反而升高。建議在實(shí)驗前，先檢測一下轉染效率，觀(guān)察一下，轉染進(jìn)去的整個(gè)細胞是綠的，沒(méi)有轉染進(jìn)去的是一些綠色的小點(diǎn)粘附在細胞上，發(fā)的光是點(diǎn)狀的。轉染進(jìn)去的整個(gè)細胞是綠色的，可以清晰的看到細胞形態(tài)，沒(méi)有轉染進(jìn)去的就是綠色的小點(diǎn)兒，建議多做幾個(gè)轉染梯度，找到最佳轉染條件。

2、檢測時(shí)間點(diǎn)，建議轉染后24-48小時(shí)檢測基因水平變化，48-72小時(shí)檢測蛋白水平變化。不同基因的半衰期是不同的，siRNA干擾是拋物線(xiàn)形的，多做幾個(gè)時(shí)間點(diǎn)有利于siRNA干擾效果的測定

3、推薦RT-PCR的引物應該設計在target位置的兩側，而不是同側。目前已經(jīng)知道的siRNA介導的基因knockdown機制是RSIC先介導靶mRNA的切割，切割導致靶mRNA的降解，由于切割和降解可能具有不同的時(shí)間點(diǎn)，因此，設計于同側的PCR引物可能導致假陰性結果或knockdown效率的低估。

4、RNA降解，建議-20保存，溶解后要最小量分裝，-20最好-80保存，3個(gè)月內用完，避免反復凍融或者4度保存。干粉保存最長(cháng)不要超過(guò)6個(gè)月

4、基因問(wèn)題。有的基因受細胞調控比較嚴格，mRNA能敲除，但是蛋白水平敲除不下來(lái)的，如果這樣，建議換一種細胞看看

5、干擾靶點(diǎn)不合適。需重新設計siRNA。