真核細胞轉染操作步驟

一些真核蛋白在原核宿主細胞中的表達不但行之有效而且成本低廉，然而許多在細菌中合成的真核蛋白或因折疊方式不正確，或因折疊效率低下，結果使得蛋白活性低或無(wú)活性。不僅如此，真核生物蛋白的活性往往需要翻譯后加工，例如二硫鍵的精確形成、糖基化、磷酸化、寡聚體的形成或者由特異性蛋白酶進(jìn)行的裂解等等，而這些加工原核細胞則無(wú)能為力。需要表達具有生物學(xué)功能的膜蛋白或分泌性蛋白，例如位于細胞膜表面的受體或細胞外的激素和酶，則更需要使用真核轉染技術(shù)。由于DNA導入哺乳動(dòng)物細胞有關(guān)技術(shù)方法的發(fā)展，使真核表達成為可能。

利用克隆化的真核基因在哺乳動(dòng)物細胞中表達蛋白質(zhì)，具有以下多種不同用途：

(1) 通過(guò)對所編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行免疫學(xué)檢測或生物活性測定，確證所克隆的基因。

(2) 對所編碼的蛋白質(zhì)須進(jìn)行糖基化或蛋白酶水解等翻譯后加工的基因進(jìn)行表達。

(3) 大量生產(chǎn)從自然界中一般只能小量提取到的某些生物活性蛋白。

(4) 研究在各種不同類(lèi)型細胞中表達的蛋白質(zhì)的生物合成以及在細胞內轉運的情況。

(5) 通過(guò)分析正常蛋白質(zhì)及其突變體的特性，闡明蛋白質(zhì)結構與功能的關(guān)系。

(6) 使帶有內含子而不能在原核生物如酵母中正確轉錄為 mRNA的基因組序列得到表達。

(7) 揭示某些與基因表達調控有關(guān)的DNA序列元件。

DNA轉染技術(shù)現已變成研究基因功能和組分的重要工具，已發(fā)展了很多轉染方法，并成功應用于轉染各種細胞。目前廣泛應用方法有磷酸鈣共沉淀法、電穿孔法、病毒載體，以及陽(yáng)離子脂質(zhì)體介導轉染法。

進(jìn)行真核轉染的一般程序：

克隆目的基因(經(jīng)測序驗證)-準備真核表達載體-將目的基因插入表達載體中-轉染-篩選-鑒定

下面以pcDNA3為載體，p16為目的基因，介紹真核轉染的實(shí)驗操作。

一、試劑準備

1、HBS(Hepes-buffered saline)：876mg NaCl溶于90ml ddH2O，加入1M Hepes,調pH到7.4,補ddH2O至100ml, pH7.4，濾過(guò)除菌。

2、核酸貯存液，過(guò)濾除菌。

3、培養基：含血清或不含血清的，用于轉染細胞的正常培養。

二、操作步驟

(一)克隆目的基因

1、根據GenBank檢索的目的基因序列，設計擴增引物，并在上、下游引物的5’-端分別引入酶切位點(diǎn)BamHⅠ和XhoⅠ，行RT-PCR。

2、回收特異性擴增片段，連入T載體。

3、轉化DH5α，質(zhì)粒制備。

4、酶切初步鑒定，測序證實(shí)。

(二) 真核重組表達載體的構建：

pcDNA3載體帶有在大腸桿菌中復制的原核序列、便于挑選帶重組質(zhì)粒細菌的抗生素抗性基因，以及表達外源DNA序列所必需的所有真核表達組件。

重組質(zhì)粒與pcDNA3分別用BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切

回收插入片段和pcDNA3線(xiàn)性片段

T4連接酶連接

轉化DH5α

質(zhì)粒制備

BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定。

(三)重組pcDNA3轉染SHG-44細胞：

1、 G418篩選濃度測定：SHG-44培養于24孔培養板→G418 分別用100mg/L、200mg/L、300mg/L、400mg/L、500mg/L、600mg/L加入，各濃度3復孔，設正常對照3復孔。以10-14天細胞全部死亡的濃度為篩選濃度，結果為200mg/L。

2、 在轉染實(shí)驗前天接種細胞，各種細胞的平板密度依據各種細胞的生長(cháng)率和細胞形狀而定。進(jìn)行轉染當天細胞應達到60%-80%覆蓋。一般要求，6孔培養皿(35mm)，每孔1-2ml培養基3×105細胞。依據不同大小培養板調整每平方厘米的細胞數量。

典型貼壁細胞平板密度

3、 SHG-44細胞的轉染：

(1) 轉染當天，加入脂質(zhì)體/ DNA混合物之前的短時(shí)間內，更換1ml新鮮的有血清或無(wú)血清培養基。

(2) 準備不同比例的DOSPER/ DNA混合物，以確定每個(gè)細胞系的最佳比例。① 溶液A：用HBS稀釋DNA(pcDNA3、重組pcDNA3)各1.5μg 到總體積50μl(30μg/ml)。②溶液B：用HBS稀釋6μl脂質(zhì)體到終容積50μl(120μg/ml)。③混合溶液A和B，輕柔混合(不要振蕩)，室溫孵育15min，以便脂質(zhì)體/DNA混合物形成。

(3) 不要移去培養基，逐滴加入100μl 脂質(zhì)體/DNA混合物(從培養孔一邊到另一邊)，邊加邊輕搖培養板。

(4) 37℃孵育6hr。

(5) 6hr后更換轉染培養基，加入2-3ml新鮮生長(cháng)培養基。

(6) 轉染24hr后施加篩選壓力，改用含G418的培養基培養。

4、 G418篩選：在G418篩選濃度下持續培養14天后，挑出單克隆，擴大培養，同時(shí)轉染pcDNA3即SHG-44-vect，并設對照組細胞即SHG-44。

(一)篩選結果鑒定：

(1)基因組DNA提取→PCR鑒定外源基因

(2)SHG-44-重組pcDNA3陽(yáng)性細胞、SHG-44-vect裂解→聚丙烯酰胺凝膠電泳→免疫印跡鑒定P16蛋白表達(Western-blot)。

(3)測定外源性基因對SHG-44細胞增殖的影響

①流式細胞儀分析：SHG-44、SHG-44-vect、SHG-44-重組pcDNA3→單細胞懸液→70%酒精固定→裂解細胞→核糖核酸酶消化→碘化丙啶染色→上機分析G1期和G2/M、S期比例。

②細胞生長(cháng)曲線(xiàn)測定：SHG-44、SHG-44-vect、SHG-44-重組pcDNA3→5×104/孔接種24孔培養板→24hr后各自用苔盼藍染色計數細胞→計算細胞生長(cháng)抑制百分率。

③軟瓊脂克隆形成率分析：SHG-44、SHG-44-vect、SHG-44-重組pcDNA3→104 細胞→0.3%低熔點(diǎn)瓊脂糖培養→1-2周后計數不可少于50個(gè)細胞的克隆數→計算克隆形成率抑制率。

三、注意事項

1、優(yōu)化轉染條件(脂質(zhì)體的用量、DNA密度、細胞密度、脂質(zhì)體和DNA混合孵育時(shí)間)每種細胞和質(zhì)粒均須進(jìn)行。用于轉染的核酸應高度純化。為避免微生物污染，所用溶液濾過(guò)滅菌，以及隨后的使用應在無(wú)菌條件下，這是細胞慣常的做法。但是，脂質(zhì)體以及脂質(zhì)體/ DNA混合物無(wú)需濾過(guò)除菌。

2、預備脂質(zhì)體/DNA混合物必須在無(wú)血清下進(jìn)行。但是在隨后的脂質(zhì)體/ DNA與被轉染細胞共孵育的過(guò)程中，血清又是培養基的一部分。

3、在轉染之前更換培養基，可提高轉染效率，但所用培養基必須37℃預溫。

脂質(zhì)體/ DNA混合物應當逐滴加入，盡可能保持一致，從培養皿一邊到另一邊，邊加入邊輕搖培養皿，以確保均勻分布和避免局部高濃度。