qPCR實(shí)驗為什么要制作熔解曲線(xiàn)？

熒光DNA結合染料法的缺點(diǎn)是它們能在反應中結合所有DNA雙鏈，包括在實(shí)時(shí)熒光PCR中產(chǎn)生的引物二聚體，和其他非特異性產(chǎn)物，引起大量的背景噪聲信號。

這種噪聲會(huì )影響我們對靶基因產(chǎn)量的評估，甚至熒光強度和靶基因的起始量、全長(cháng)根本沒(méi)什么關(guān)系。

因此，我們使用熒光DNA染料結合法時(shí)，需要對擴增產(chǎn)物進(jìn)行熔解曲線(xiàn)的分析。通過(guò)對擴增反應產(chǎn)物逐漸升溫，同時(shí)監測每一步的熒光信號來(lái)制作熔解曲線(xiàn)。

熔解曲線(xiàn)的縱坐標是熒光信號值，橫坐標是溫度值。通過(guò)觀(guān)察產(chǎn)生的信號峰和對應溫度，可以判斷產(chǎn)物狀態(tài)。

理想情況下，熔解曲線(xiàn)應該是單峰，峰值對應溫度是特異性產(chǎn)物的退火溫度，這才能說(shuō)明擴增產(chǎn)物中特異性產(chǎn)物占比大。熒光DNA結合染料法的缺點(diǎn)是它們能在反應中結合所有DNA雙鏈，包括在實(shí)時(shí)熒光PCR中產(chǎn)生的引物二聚體，和其他非特異性產(chǎn)物，引起大量的背景噪聲信號。

這種噪聲會(huì )影響我們對靶基因產(chǎn)量的評估，甚至熒光強度和靶基因的起始量、全長(cháng)根本沒(méi)什么關(guān)系。

因此，我們使用熒光DNA染料結合法時(shí)，需要對擴增產(chǎn)物進(jìn)行熔解曲線(xiàn)的分析。通過(guò)對擴增反應產(chǎn)物逐漸升溫，同時(shí)監測每一步的熒光信號來(lái)制作熔解曲線(xiàn)。

熔解曲線(xiàn)的縱坐標是熒光信號值，橫坐標是溫度值。通過(guò)觀(guān)察產(chǎn)生的信號峰和對應溫度，可以判斷產(chǎn)物狀態(tài)。

理想情況下，熔解曲線(xiàn)應該是單峰，峰值對應溫度是特異性產(chǎn)物的退火溫度，這才能說(shuō)明擴增產(chǎn)物中特異性產(chǎn)物占比大。