DNA提取的8個(gè)問(wèn)題解答

質(zhì)粒DNA的提取是DNA技術(shù)中的必需實(shí)驗技能。分離質(zhì)粒DNA一般分為三個(gè)步驟：

1、培養細菌使質(zhì)粒擴增

2、收集和裂解細菌

3、分離和純化質(zhì)粒

DNA堿裂解法是較常用的提取的方法，在質(zhì)粒提取過(guò)程中，由于機械力、酸堿度、試劑等的原因，可能使質(zhì)粒DNA鏈發(fā)生斷裂。所以，多數質(zhì)粒粗提取物中含有三種構型的質(zhì)粒：共價(jià)閉合環(huán)狀DNA(cccDNA)：質(zhì)粒的兩條鏈沒(méi)有斷裂;超螺旋開(kāi)環(huán)DNA(ocDNA)

而在DNA提取中總會(huì )遇到各種一些問(wèn)題，導致實(shí)驗無(wú)從下手，下面我們來(lái)分析一些常見(jiàn)的問(wèn)題：

一、為什么用無(wú)水乙醇沉淀DNA?

乙醇的優(yōu)點(diǎn)是可以任意比和水相混溶，乙醇與核酸不會(huì )起任何化學(xué)反應，當加入乙醇時(shí)，乙醇會(huì )奪DNA周?chē)乃肿?，使DNA失水而易于聚合。一般實(shí)驗的做法是：初次沉淀DNA時(shí)可用95%乙醇代替無(wú)水乙醇，最后的沉淀步驟要使用無(wú)水乙醇。也可以用0.6倍體積的異丙醇選擇性沉淀DNA。一般在室溫下放置15-30分鐘即可。

二、在用無(wú)水乙醇沉淀DNA時(shí)，為什么一定要加NaAC或NaCL至最終濃度達0.1-0.25MOL/L?

在Ph為8左右的DNA溶液中，DNA分子是帶負電荷的，加一定濃度的NaAC或NaCL，使Na+中和DNA分子上的負電荷，減少DNA分子之間的同性電荷相斥力，易于互相聚合而形成DNA鈉鹽沉淀，當加入的鹽溶液濃度太低時(shí)，DNA沉淀不*，反之DNA難以收集。在沉淀的DNA過(guò)程中，由于過(guò)多的鹽雜質(zhì)存在，影響DNA的酶切等反應，必須要進(jìn)行洗滌或重沉淀。

三、為什么在保存或抽提DNA過(guò)程中，一般采用TE緩沖液?

在基因操作實(shí)驗中，選擇緩沖液的主要原則是考慮DNA的穩定性及緩沖液成分不產(chǎn)生干擾作用，所以采用Tris-HCL(pKa=8.0)的緩沖系統，由于緩沖液是TrisH /Tris，不存在金屬離子的干擾作用，故在提取或保存DNA時(shí)，TE緩沖液中的EDTA更能穩定DNA的活性。加核糖核酸酶降解核糖核酸后，要用SDS與Kac來(lái)處理一次，可以讓沉淀更加*。

四、如何選擇聚乙二醇(6000)的濃度來(lái)沉淀DNA?

采用PEG(6000)沉淀DNA，大小不同的DNA分子所用的PEG的濃度也不同，PEG的濃度低，選擇性沉淀DNA分子量大，大分子所需PEG的濃度只需1%左右，而小分子所需PEG濃度在20%左右

五、為什么用酚與氯仿抽提DNA時(shí)，還要加少量的異戌醇？

在抽提DNA時(shí)，為了混合均勻，必須劇烈振蕩容光煥發(fā)器數次，加入異戌醇能降低分子表面張力，減少在振蕩時(shí)氣泡的產(chǎn)生；配比一般是氯仿與異戌醇為24：1，也可以采用酚，抽提DNA去除蛋白質(zhì)時(shí)，由于酚與氯仿是互溶的，可用氯仿第二次變性蛋白質(zhì)，此時(shí)一起將酚帶走。也可以在第二次抽提時(shí)，將酚與氯仿混合(1：1)使用

六、為什么要用pH8的Tris水溶液飽和酚?

因為酚與水有一定的互溶。苯酚用水飽和的目的是使其抽提DNA過(guò)程中，不致吸收樣品中含有DNA的水分，減少DNA的損失。用Tris調節至PH為8是因為DNA在此條件下比較穩定。

七、呈粉紅色的酚可以使用嗎?

保存在冰箱中的酚，容易和空氣中的氧氣發(fā)生化學(xué)反應而變成粉紅色的，這樣的酚容易降解DNA，一般不可以使用

八、怎么保存酚不被空氣氧化？

加入巰基乙醇和8-羥基喹啉至終濃度為0.1%。8-羥基喹啉是帶有淡黃色的固體粉末，不僅能抗氧化，并在一定程度上能抑制Dnase的活性。用Tris PH8.0水溶液飽和后的酚，最好分裝在棕色小試劑瓶里，上面蓋一層Tris水溶液或TE緩沖液，隔絕空氣，也可以往瓶里充入氮氣，防止與空氣接觸而被氧化。然后保存在4℃或-20℃冰箱中，可以保存幾個(gè)月不會(huì )變色。