三天征服Chip的經(jīng)驗分享

在科研界，CHIP 無(wú)疑是高冷的女神，在追逐的過(guò)程總是分分鐘虐得體無(wú)完膚，糟心的實(shí)驗結果更是分分鐘想去“狗帶"。征服 CHIP 的路上，有多虐心就有多少要注意的地方。慶幸的是，曾得到女神青睞的前輩們積累了不少經(jīng)驗。好的經(jīng)驗要分享，特地總結了各位高手們做 CHIP 的經(jīng)驗，在此奉上，希望能助大家一臂之力。

染色質(zhì)免疫共沉淀（chromatin immunoprecipitation，CHIP）是目前研究體內 DNA 與蛋白質(zhì)相互作用的*方法，能夠比較真實(shí)的反應細胞內轉錄因子 TF 與啟動(dòng)子 Promoter 的結合情況。其基本原理：在活細胞狀態(tài)下，把胞內 DNA 與蛋白質(zhì)交聯(lián)成復合物，通過(guò)超聲或酶處理將染色質(zhì)隨機切斷為一定長(cháng)度范圍內的小片段，然后利用抗原抗體特異性識別反應，將與目的蛋白結合的 DNA 沉淀下來(lái)，特異性富集目的蛋白結合 DNA 片段，進(jìn)而對目的片斷進(jìn)行純化與檢測（如 qPCR、基因芯片、測序等），從而獲得蛋白質(zhì)與 DNA 相互作用的信息。

CHIP 主要分為兩種：交聯(lián)染色質(zhì)免疫沉淀（Cross-linkedChip，XChip）和自然染色質(zhì)免疫沉淀（Native Chromatin Immunoprecipitation, NChip）。兩者的區別在于 XCHIP 需要甲醛固定，適合于結合力較弱的 DNA-蛋白質(zhì)相互作用的研究；而 NCHIP 則不需要甲醛固定，不需要交聯(lián)反應，主要用于組蛋白修飾（如組蛋白 H3 和 H4，它們本身與 DNA 結合非常緊密）、核小體定位的研究。在 NCHIP 中，DNA 結合蛋白與 DNA 之間保持一種自然狀態(tài)，需要采用微球菌核酸酶對染色質(zhì)進(jìn)行消化。 一般而言，我們所提的染色質(zhì)免疫共沉淀指的是 XCHIP。那么長(cháng)話(huà)短說(shuō)，將 XCHIP 三天實(shí)驗中的常見(jiàn)流程及注意事項分享給大家。 

第一天 

細胞的甲醛交聯(lián) 

1）收集細胞，加入甲醛（終濃度為 1%），37℃孵育 10min 后，加入甘氨酸（終濃度為 0.125M），混勻后在室溫下放置 5min 即可。 

2）離心棄上清，收細胞于 15ml 離心管中，用 3ml 預冷的 1×PBS 洗兩次后，預冷后 2000rpm  5min 收集細胞。 

3）棄上清，按照細胞量，加入 SDS Lysis Buffer，使細胞濃度為 1×106 個(gè)/100 ul。再加入蛋白酶抑制劑復合物。

Tip: 

1、細胞生長(cháng)狀態(tài)要好，因其生長(cháng)狀態(tài)直接影響細胞內部的基因表達調控網(wǎng)絡(luò )，可能會(huì )影響你所研究的 TF 與 Promoter 的結合。因而，一般細胞長(cháng)到 75%-80%比較好。

2、交聯(lián)程度會(huì )影響到超聲破碎的效果，交聯(lián)程度越高，超聲破碎就越不易把基因組打碎成小片段，背景色加深；交聯(lián)不充分，則只有一部分靶蛋白與 Promoter 結合，富集得到的 Promoter 的量不高，產(chǎn)生實(shí)驗假陰性。建議樣品交聯(lián)的時(shí)間為 2-30min。 

3、用 SDS 重懸細胞時(shí)，要選用小的 tip 頭，在液面下吹打，否則很容易產(chǎn)生氣泡，會(huì )對后續超聲破碎帶來(lái)不便。

超聲破碎 

1）冰上孵育 10min 后，利用超聲波或微球菌酶將染色質(zhì)隨機切為 200~1000bp 的小片段。 14000rpm 離心 10min（4℃），轉移上清于 1.5ml EP 管中。 

2）取出 100ul 超聲破碎產(chǎn)物，加入 4ul 5M NaCl（終濃度為 0.2M），65℃處理 4h 進(jìn)行解交聯(lián)，電泳檢測超聲破碎的效果。 

3）另取出 100ul 超聲破碎產(chǎn)物，加入 900ul ChIP Dilution Buffer 和 20 ul 的 50× PIC，再加入 60ul Protein A Agarose/Salmon Sperm DNA，去除非特異性。4℃顛轉混勻 1h 后，1000rpm 離心 3min，收集上清。

Tip: 

1、不同細胞系需不同的超聲時(shí)間才能達到*效果，則可通過(guò)時(shí)間梯度的超聲來(lái)選擇*超聲條件。

2、每份超聲樣品取 50ul，標記為 input，用于定量 DNA 濃度（稀釋 200 倍，測 OD260）和作為 PCR 空白對照。同時(shí)超聲后樣品應立刻存于-70℃中，避免多次反復凍融。 

3、加入 Protein A Agarose/Salmon Sperm DNA 之前一定要混勻，因為 Salmon sperm DNA 是很粘稠的物質(zhì)，若不混勻，后面 beads 量不一樣，對實(shí)驗結果產(chǎn)生影響。

第二天 

免疫共沉淀

1）一管加入 1ul 抗體，另一管中則不加抗體作為對照。4℃顛轉過(guò)夜。 

2）孵育過(guò)夜后，每管加入 60ul Protein A Agarose/Salmon Sperm DNA，沉淀抗體/抗原復合物， 4℃顛轉 1h。1000rpm 4℃ 3min 收集沉淀，棄上清。 

Tip: 

1、每個(gè)樣品都采用 25ug 的 DNA 量，同時(shí)抗體的量為 1-10ug 的抗體/25ulDNA。 

2、單抗與多抗的選擇也需慎重考慮。單抗特異性強，背景低，但是識別位點(diǎn)單一，在 CHIP 甲醛交聯(lián)過(guò)程中，很有可能該位點(diǎn)被其他蛋白或核酸結合而被封閉，導致單抗不能識別靶蛋白。多抗雖然沒(méi)有此問(wèn)題，但是特異性差，背景可能會(huì )偏高。一般建議選擇多抗；選擇單抗時(shí)要注意其識別位點(diǎn)需遠離靶蛋白與核酸結合的區域。

純化 DNA 片段 

1）依次用下列溶液清洗沉淀復合物。清洗過(guò)程：加入溶液 1ml，在 4℃旋轉 5min，1000rpm  3min，去除上清。 

洗滌液： 低鹽免疫復合物洗脫液，洗一次；高鹽免疫復合物洗脫液，洗一次；氯化鋰免疫復合物洗脫液，洗一次； TE Buffer，洗兩次。

2）清洗完畢后，進(jìn)行洗脫。每管加入 250ul 洗脫液，室溫下顛轉 15min，1000rpm 3min，收集上清液。最終的洗脫液為每管 500ul。

洗脫液： 100ul 10% SDS，100ul 1M NaHCO3 ，800ul ddH2O ，共 1ml。 

3）解交聯(lián)：每管加入 20ul 5M NaCl（終濃度為 0.2M），混勻后，65℃解交聯(lián)過(guò)夜。

Tip: 

1、洗滌時(shí)，前幾個(gè)步驟可以不用洗的太干凈，但最后一個(gè)要盡量吸取干凈，必要時(shí)可用 gel  loading tips 吸取上清液。 

2、含 beads 的樣品離心時(shí)，轉速不能太快，防止 beads 破碎，但如果采用的是磁性的 beads 就不存在這個(gè)問(wèn)題。 

3、解交聯(lián)時(shí)，建議在離心前，先把蒸發(fā)到離心管蓋子上的部分離下來(lái)。

第三天 

DNA 樣品的回收 

1）每管加入 1ul RNaseA（MBI），37℃孵育 1h。 

2）每管加入 10ul 0.5M EDTA，20ul 1M Tris.HCl（pH 6.5），2ul 10mg/ml 蛋白酶 K。45℃處理 2h。

3）DNA 片段回收—OMEGA 膠回收試劑盒，最終的樣品溶于 100ul ddH2O

Tip: 

1、樣品中 SDS 含量較高時(shí)，普通 PCR 回收試劑盒進(jìn)行 DNA 片段回收時(shí)，在過(guò)柱前，可在樣品中加入一定量的異丙醇，這樣可有效消除 SDS 沉淀。 

2 、一個(gè) CHIP 一般需要 3~4 天時(shí)間，其中有幾個(gè)步驟是可以停下來(lái)的： 

（1）細胞收集：用含蛋白酶抑制劑的 PBS 洗滌離心，去上清的細胞收集液可置-80℃凍存； 

（2）用 SDS 重懸細胞后可置-80℃凍存； 

（3）超聲破碎結束時(shí)，離心后的上清置新的離心管后可置-80℃凍存；

（4）解交聯(lián)后的標本可置-80℃凍存

DNA 樣品分析 

如果目的蛋白的靶序列已知，或懷疑某一序列是目的蛋白靶序列，可選用定量或者半定量 PCR 方法。如果目的蛋白的靶序列未知或要研究目的蛋白基因組分布情況，找出轉錄因子結合位點(diǎn)，則可采用 CHIP 克隆測序（CHIP-seq）、CHIP-chip 等方法。

PCR 分析 

目前檢測方法主要有 3 種： 

CHIP-qPCR：用于比較沉淀的模板與陰性和陽(yáng)性對照信號強度的相對精確的定量 PCR 方法。成本較低。此外，還有一些由 ChIP 衍生出來(lái)的方法，如 RIP（即用 ChIP 的方法研究細胞內 蛋白與 RNA 相互結合，具體方法和 ChIP 差不多，只是實(shí)驗過(guò)程中要注意防止 RNase，最后 分析時(shí)需先將 RNA 逆轉錄為 cDNA）

Tip : 

1、1~10ul 的移液槍取 3ul 以上才比較準確，要考慮好自己 PCR 反應體系的配置。 

2、每次 qPCR 之前都要把 sample 離心保證取樣的準確。 

CHIP-chip：Chip 和 DNA 微陣列芯片技術(shù)結合是種高通量分析 DNA 和蛋白質(zhì)結合或翻譯后染 色質(zhì)和組蛋白修飾的方法。即將經(jīng)過(guò)染色質(zhì)免疫共沉淀的 DNA 樣品純化后進(jìn)行 PCR 擴增， 然后用熒光素標記（如 Cy3）。對沒(méi)有經(jīng)過(guò)免疫沉淀反應富集的 Input DNA 樣品也進(jìn)行擴增， 并且用另一種熒光素標記（如 Cy5），作為結合背景的參照。之后將這兩種 DNA 雜交于包括 基因組序列的微陣列芯片上，轉錄因子結合的靶序列用每個(gè)點(diǎn)相應的熒光強度來(lái)確定。

CHIP-seq：在測序深度和范圍足夠的情況下,ChIP-seq 可以檢測到所有的組蛋白修飾所對應的 DNA 結合位點(diǎn)。ChIP-seq 首先通過(guò)染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)特異地富集目的蛋白結合的 DNA 片段,并對其進(jìn)行純化與文庫構建,然后以 NGS 技術(shù)對富集到的 DNA 片段進(jìn)行高通量測序。 

（NGS 技術(shù)主要是利用 DNA 新模板的合成或連接過(guò)程, 用高效平行的方式同時(shí)對 DNA 模板 進(jìn)行測序, 從而獲得大量的測序數據, 即所謂的大規模平行測序。）