CO-IP沒(méi)有條帶的常見(jiàn)原因和解決的辦法

CO-IP 并不容易做，尤其是兩個(gè)蛋白豐度低，相互作用力較弱的時(shí)候。做 CO-IP 經(jīng)常會(huì )遇到?jīng)]有條帶的問(wèn)題。這里談?wù)?CO-IP 沒(méi)有條帶的常見(jiàn)原因和解決的辦法，更有獨門(mén)配方獻上。

蛋白濃度過(guò)稀 

絕大多數情況下，CO-IP 沒(méi)有條帶是由于蛋白濃度過(guò)稀。裂解產(chǎn)物的蛋白濃度越高越好。但是，有些實(shí)驗室喜歡稀釋裂解樣品的蛋白濃度再做 CO-IP。其實(shí)，在大多數情況下要盡可能避免稀釋你的細胞裂解液。盡量使細胞裂解產(chǎn)物的蛋白濃度可達 7-8 mg/ml 左右。這才會(huì )避免發(fā)生沒(méi)有條帶的情況。

沒(méi)有裂解開(kāi) 

很多時(shí)候，由于裂解液不夠強烈，蛋白質(zhì)復合物沒(méi)有分開(kāi)，也會(huì )造成沒(méi)有條帶的問(wèn)題。解決辦法是：加溫和加少量的 SDS 增加變性能力。這里再介紹一個(gè)小竅門(mén)：最初幾遍的漂洗 buffer 要和 IP 時(shí)的鹽濃度相同。純化蛋白的時(shí)候，如果用低鹽裂解細胞，高鹽漂洗去雜質(zhì)，蛋白丟失較多。再奉獻一個(gè)獨門(mén)配方：20 mM Tris/HCl，pH7.6，100 mM  NaCl，20 mM KCl，1.5 mM MgCl2，0.5% NP-40 and protease inhibitors （0.5M PMSF）。包用包好。

量不合適

很多時(shí)候，CO-IP 沒(méi)有條帶，是由于蛋白量，珠子，抗體的量需要調整。根據經(jīng)驗，一般 100ug 蛋白，3ug 抗體，30ug 珠子。如果不行，250ug 蛋白，5ug 抗體，或者 500ug 蛋白，7ug 抗體。

抗體太坑

抗體是 CO-IP 成敗的致命因素之一！必須是 IP 級別的抗體。說(shuō)句不好聽(tīng)的話(huà)，不要用國產(chǎn)抗體和 Santa Cruz 的抗體。這些抗體在做 CO-IP 的實(shí)驗室里面已經(jīng)臭名遠揚了?？尤藷o(wú)數。大家就不要再重蹈覆轍了。 

單抗與多抗的選擇也需要仔細考慮。兩種抗體各有利弊。單抗特異性強，背景低。但是單抗有一個(gè)致命的弱點(diǎn)，就是識別位點(diǎn)單一，而在 CO-IP 過(guò)程中，該位點(diǎn)很有可能與其它蛋白或核酸結合而被封閉，導致單抗不能識別靶蛋白而沒(méi)有條帶。所以，如果沒(méi)有十足把握，單抗的識別位點(diǎn)遠離靶蛋白與核酸結合的區域，還是選擇多抗比較穩妥一些。至少不會(huì )出現沒(méi)有條帶的問(wèn)題。

細胞數量太少 

很多時(shí)候，CO-IP 沒(méi)有信號是由于細胞數量太少。一般是 145 mm 的培養皿，至少要長(cháng)到 50%以上。如果低于這個(gè)數目，CO-IP 就很有可能沒(méi)有信號。除非藥品和試劑非常非常昂貴，否則就不要節約這點(diǎn)細胞了。一旦 CO-IP 實(shí)驗失敗，浪費的時(shí)間可是更寶貴的。

綜上所述，CO-IP 是比較難做的一個(gè)實(shí)驗。很多時(shí)候，能否成功取決于抗體和兩個(gè)蛋白的結合常數，和 protocol 和實(shí)驗操作本身的關(guān)系不大。以上，介紹了一些經(jīng)驗體會(huì )和小技巧小竅門(mén)，希望對大家有所幫助。