提高效率與質(zhì)量的實(shí)用技巧

1、提高實(shí)驗的效率

1）實(shí)驗前有計劃安排、預備方案或者“車(chē)輪戰"（細胞實(shí)驗）

一般從基礎的培養細胞開(kāi)始，開(kāi)始實(shí)驗時(shí)，實(shí)驗方法一般來(lái)自于實(shí)驗室或者文獻中條件優(yōu)化以及自我推測及驗證，因此做實(shí)驗之前預想實(shí)驗方案有助于我們不至于“手忙腳亂"。

以實(shí)驗前的細胞鋪板實(shí)驗為例：

表1 常用細胞培養體系：

細胞鋪板的孔數一般取決于我們后期實(shí)驗的目的，實(shí)驗前了解各類(lèi)細胞的鋪板數量以及培養基添加量都十分重要。以病毒或者細菌感染細胞模型來(lái)說(shuō)，我們需要一個(gè)比較準確數量級的細胞數目和病毒或菌液濃度得后期實(shí)驗的MOI值，細胞計數和病毒及菌液濃度測定也很關(guān)鍵；

細胞鋪板：我們需要收集盡可能多的細胞，原因是當我們剩余出來(lái)的細胞可用于細胞傳代繼續保留，可若是鋪板數量達不到（重新離心收集細胞浪費時(shí)間）可能會(huì )導致加藥濃度過(guò)大使得細胞大量死亡而影響后期實(shí)驗，比如你要提取RNA或者蛋白，細胞數目不足，后期的RNA濃度或者BCA測蛋白濃度的結果都不是非常理想繼而影響后面實(shí)驗的進(jìn)展。

2）具體安排（Western blot實(shí)驗）

從試驗干擾開(kāi)始（給藥處理），根據實(shí)驗步驟來(lái)講，完整的Western blot實(shí)驗預計2-3天。

（1）以給藥時(shí)間24h為例：24h后，收集細胞提取蛋白，貼壁細胞加IP裂解液或RIPA裂解液用細胞刮板移至1.5ml離心管；懸浮細胞收集細胞至離心管離心去除培養基，用PBS清洗離心去除上清再加入裂解液，預計提取蛋白以及BCA測蛋白濃度一上午的時(shí)間，估計上樣體積加入loading buffer煮蛋白置于-80℃保存；下午跑蛋白電泳，SDS-PAGE膠可于前一天晚上制好防止-4℃冰箱保存（用少量純水用封裝袋保存）或使用預制膠，大概1多小時(shí)蛋白maker跑到距離膠最下面1-2cm處停止電泳；轉模，根據目的蛋白的大小確定轉膜時(shí)間和毫安數，結束后裁膜用5%脫脂奶粉封閉，之后孵育一抗4℃過(guò)夜，第二天洗膜孵育二抗并進(jìn)行顯影，因此步驟時(shí)間熟練的話(huà)2天就可以完成一次WB實(shí)驗。

（2）預備方案：實(shí)驗重復是不可避免的，因此預備下一周期實(shí)驗方案（車(chē)輪戰）有助于縮短時(shí)間提高效率，當然，師兄師姐以及廣大學(xué)術(shù)里的經(jīng)驗小tips也有助于提高實(shí)驗效率。例如，在WB配制SDS-PAGE膠的凝固時(shí)間通常會(huì )隨季節溫度的變化而改變，夏季和冬季應該時(shí)間就會(huì )產(chǎn)生差異（冬季凝固較慢），再者，AP 和TEMED 作為促凝劑，一般都是最后加入，尤其是AP（過(guò)硫酸銨）。實(shí)驗之前我們可能都會(huì )設計一個(gè)預期結果，我們可以在上一周期實(shí)驗的空余時(shí)間預備下一周所需要的實(shí)驗條件，例如重新細胞鋪板給藥等待時(shí)間周期等等。

2、提高實(shí)驗結果的質(zhì)量：減小系統誤差，消除人為錯誤

以qPCR為例：該實(shí)驗檢測基因的mRNA表達水平，操作過(guò)程要求一定的準確性，因為加樣體系較小，各試劑的加樣量更要求精準，下面是一些來(lái)自個(gè)人的小tips:

①減小系統誤差：一般設計3個(gè)重復孔，但是后期我統計數據時(shí)發(fā)現，誤差bar仍可能較長(cháng)，這時(shí)我們可以設計4個(gè)復孔，去除一個(gè)誤差最大的值也有助于結果的準確性。這時(shí)就要求我們會(huì )更加精準的使用移液槍。另外，重復實(shí)驗也有助于提高我們加樣的準確性。

②制備預混液：例如我要做30(2×5×3)孔兩個(gè)基因（包含內參），5個(gè)處理，3個(gè)復孔，那么我的熒光染料一個(gè)孔需要5ul，正反引物2ul，那么我們可以再不浪費試劑的情況下，計算量可為:15.5×5+15.5×2或者（15×5+15×2）×1.1，這一定程度上都是為了消除我們人為加樣誤差。

③另外我們盡量增大加樣體積減少誤差：針對于10ul體系，提前將正反引物混合，配制SYBY+正反引物和cDNA+ddH2O，這時(shí)的體積為6+4或者7+3可減少加樣體積小帶來(lái)的加樣誤差。

④相關(guān)試劑使用前需離心使用：另外，在八聯(lián)管上機前需要用干凈的手套蓋上透明蓋子，適當離心將反應體系離心至管底。

以上就是本期的內容，更多資訊，歡迎點(diǎn)擊安培生物網(wǎng)站鏈接了解更多技術(shù)與產(chǎn)品資訊。

安培生物致力成為推動(dòng)生命科學(xué)進(jìn)步值得信賴(lài)的合作者

深圳/湛江安培生物科技有限公司,是一家具有核心的技術(shù)實(shí)力、先進(jìn)的經(jīng)營(yíng)管理水平和完善的市場(chǎng)銷(xiāo)售體系的生物高科技企業(yè)?？偛吭O在廣東，服務(wù)面向全國。安培生物集進(jìn)口試劑、實(shí)驗室耗材銷(xiāo)售、技術(shù)服務(wù)與合約開(kāi)發(fā)為一體的專(zhuān)業(yè)化高科技公司，旨在為生命科學(xué)的發(fā)展提供較好的產(chǎn)品與服務(wù)。本公司建立了涵蓋分子生物學(xué)、細胞生物學(xué)、免疫學(xué)、信號傳導和神經(jīng)科學(xué)等領(lǐng)域的產(chǎn)品供應線(xiàn)，在各個(gè)領(lǐng)域內向用戶(hù)提供較高的水平和質(zhì)量穩定的產(chǎn)品，安培生物致力于為廣大的科研機構、高等院校等客戶(hù)提供各種產(chǎn)品、技術(shù)支持與服務(wù)。

可以在第一時(shí)間為用戶(hù)提供比較先進(jìn)的專(zhuān)業(yè)資訊和完備的產(chǎn)品和物流服務(wù)。 專(zhuān)業(yè)的技術(shù)力量使得我們能夠為廣大用戶(hù)提供強大的技術(shù)支持，深厚的人脈資源使得我們在全國主要城市擁有眾多的合作伙伴，安培生物非常榮幸能將世界上先進(jìn)的高科技產(chǎn)品推薦給國內從事生物學(xué)領(lǐng)域科研的老師和同仁。作為專(zhuān)業(yè)性的產(chǎn)品供應商，公司出資存備了大量現貨，配合優(yōu)秀的銷(xiāo)售隊伍以及專(zhuān)業(yè)的技術(shù)支持，隨時(shí)為客戶(hù)提供服務(wù)。