石蠟切片HE染色實(shí)驗

蘇木精-伊紅染色法 ( Hematoxylin-Eosin staining )，簡(jiǎn)稱(chēng)HE染色法，切片技術(shù)里常用的染色法之一。蘇木精染液為堿性，主要使用細胞核內的染色質(zhì)與胞質(zhì)內的核糖著(zhù)紫藍色；伊紅為酸性染料，主要使細胞質(zhì)和細胞外基質(zhì)中的成分著(zhù)紅色。

實(shí)驗步驟：

1.取樣固定

取新鮮的組織樣品，加入4%多聚甲醛組織固定液的EP管中。取樣材料應該小而薄，約黃豆粒大小。

2.脫水

采用梯度酒精濃度法脫水。通常選擇50%-60%-70%-90%-95%-100%的濃度梯度，各酒精濃度要求準確，95%以前各步驟脫水1h，95%和100%均分為兩步進(jìn)行，分別脫水30min，實(shí)驗中常將組織在后一步的95%的酒精溶液中過(guò)夜，以便進(jìn)行脫脂。

3.透明浸蠟

為了使石蠟更容易進(jìn)入組織，要對脫水后的組織進(jìn)行透明處理，二甲苯：無(wú)水乙醇（1:1）溶液和二甲苯透明樣品各30ml，在60°C的石蠟溶液中充分浸泡2h。

4.包埋和切片

通過(guò)包埋機，將浸泡后的組織塊使用蠟液包埋后，放到冷臺上凝固，之后使用刀片進(jìn)行修整，在切片機上固定好后進(jìn)行連續切片（5um），所得的切片用銀子在42°C溫水中展開(kāi)，之后固定在載玻片上，經(jīng)40°C烘干后進(jìn)行HE染色。

5.HE染色

HE染色的程序是將切片浸入二甲苯ⅠⅡ，95%酒精，90%酒精,80%酒精,70%酒工各15min.二甲苯:100%酒精(1 :1),100%酒精Ⅰ,50%酒精,蒸餾水各2 min,蘇木精染液5~10 min,水洗后分化入1%鹽酸酒精5 s,自來(lái)水10min,1%氨水藍化,自來(lái)水,50%,70%,80%,90%和95%酒精各2 min,伊紅染液5 min,95%酒精,100%酒精ⅠⅡ,100%酒精:二甲苯(1: 1),二甲苯I、各2 min。中性樹(shù)脂封片，不應該等切片上的二甲苯干了再封固。

注意事項：

染色過(guò)程需要優(yōu)化，染色狀況與組織或細胞的種類(lèi)有關(guān)，也隨著(zhù)生活周期及病理變化而改變；

①固定時(shí)要注意組織在固定液中的位置,并且隨時(shí)翻動(dòng)組織,使其充分固定。

②若組織脫水不凈時(shí)，則會(huì )造成隨后的透明和浸蠟過(guò)程中二甲苯和石蠟液無(wú)法滲入組織,所以應該保證脫水液體的濃度,并經(jīng)常更換新溶液。

③透明：一般30分鐘就可達到透明的程度，但溫度較低時(shí)可適當延長(cháng)時(shí)間或置于溫箱中加熱。

④浸蠟、包埋：浸蠟和包埋要盡量在恒溫下操作，防止中間出現溫度差，蠟的溫度要適宜，蠟塊中不能出現氣泡、裂隙?斑點(diǎn)?對于碎小組織要盡可能使其處于同一平面，否則會(huì )造成切片不全與漏切。

⑤切片：在夏季切片時(shí)，為保持蠟塊硬度，可把蠟塊放于冰柜中切時(shí)取出組織蠟塊四周在切片前應修齊大小適當。不宜過(guò)重過(guò)猛，容易造成切片厚薄不均，甚至毀壞蠟塊。

⑥染色：染色前切片脫蠟要透徹。染色時(shí)間要根據染液的新舊適當調整，必要時(shí)在染色過(guò)程中用顯微鏡觀(guān)察，染色過(guò)程中避免陽(yáng)光照射。染色過(guò)程中水沖洗不宜太猛。

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