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瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗的注意事項
發(fā)布時(shí)間: 2024-05-31 點(diǎn)擊次數: 91次一、瓊脂糖凝膠的特點(diǎn)
核酸分子是兩性解離分子,在高于其等電點(diǎn)的電泳緩沖液中,其堿基不解離,而磷酸基團全部解離,核酸分子因而帶負電荷,電泳時(shí)向正極遷移。
瓊脂糖主要從海洋植物瓊脂中提取而來(lái)并經(jīng)糖基化修飾,為一種聚合鏈線(xiàn)性分子,使用瓊脂糖凝膠作為電泳支持介質(zhì),發(fā)揮分子篩功能,使得大小和構象不同的核酸分子的遷移率出現較大差異,從而達到分離的目的。
因此,目前多用瓊脂糖為電泳支持物進(jìn)行平板電泳,其優(yōu)點(diǎn)如下。
(1)瓊脂糖凝膠電泳操作簡(jiǎn)單,電泳速度快,樣品不需事先處理就可以進(jìn)行電泳。
(2)瓊脂糖凝膠結構均勻,含水量大(約占98%-99%),近似自由電泳,樣品擴散較自由電流,對樣品吸附極微,因此電泳圖譜清晰,分析率高,重復性好。
(3)瓊脂糖透明無(wú)紫外吸收,電泳過(guò)程和結果可直接用紫外光燈檢測及定量測定。
(4)電泳后區帶易染色,樣品極易洗脫,便于定量測定。制成干膜可長(cháng)期保持。
二、DNA的瓊脂糖凝膠電泳
瓊脂糖凝膠電泳對核酸的分離作用主要是依據它們的相對分子量質(zhì)量及分子構型,同時(shí)與凝膠的濃度也有密切關(guān)系。
1.核酸分子大小與瓊脂糖濃度的關(guān)系
(1)DNA分子在凝膠中,DNA 片段遷移距離(遷移率)與堿基對的對數成反比,因此通過(guò)已知大小的標準物移動(dòng)的距離與未知片段的移動(dòng)距離時(shí)行比較,便可測出未知片段的大小。
(2)瓊脂脂糖的濃度如下表所示,不同大小的DNA需要用不同濃度的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分離。
瓊脂糖濃度與DNA分離范圍:
2.核酸構型與瓊脂糖凝膠電泳分離的關(guān)系
不同構型DNA的移動(dòng)速度次序為:供價(jià)閉環(huán)DNA(covalently closed circular,cccDNA)>直線(xiàn)DNA>開(kāi)環(huán)的雙鏈環(huán)狀DNA
當瓊脂糖濃度太高時(shí),環(huán)狀DNA不能進(jìn)入膠中,相對遷移率為0(Rm=0),而同等大小的直線(xiàn)雙鏈DNA(剛性狀棒)則可以長(cháng)軸方向前進(jìn)(Rm>0),由此可見(jiàn),這三種構型的相對遷移率主要取決于凝膠濃度,但同時(shí),也受到電流強度、緩沖液離子強度等的影響。
三、瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗方法
1、選擇適合樣品預期片段大小的瓊脂糖凝膠濃度百分比。將瓊脂糖粉末與用于運行凝膠的相同類(lèi)型的緩沖液(TAE)結合起來(lái),加熱使混合物融化,避免沸騰。
2、選擇所需尺寸的凝膠澆注模具和梳子,為樣品和marker提供足夠數量的孔,以及容納每個(gè)待裝樣品數量的孔容量。
3、膠凝固后,將凝膠放入電泳儀中,電泳液沒(méi)過(guò)凝膠,根據加入量的多少,決定混合多少u(mài)l的loding buffer,將樣液混合loding buffer用移液槍加入到凝膠中。
4、蓋上蓋子,確保電極和蓋子的方向正確,注意正負極,打開(kāi)電泳儀,設定凝膠運行的時(shí)間和電壓,根據樣品大小確定運行時(shí)間。
四、瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗技巧和注意事項
1、瓊脂糖凝膠溶液配制時(shí)總液體量不宜超過(guò)錐型瓶50%容量。
2、加熱時(shí)可以中途搖動(dòng)搖動(dòng),防止瓊脂糖凝膠凝在錐形瓶底部。
3、注意不要損傷梳底部的凝膠。防止加樣時(shí)樣品漏出。
4、凝膠濃度越低,分辨的片段越大;凝膠濃度約高,分辨的片段越??;
5、使用紫外投射儀觀(guān)察,紫外光對DNA分子有損傷作用,不可長(cháng)時(shí)間照射。從膠上回收DNA時(shí),應盡量縮短光照時(shí)間以減少紫外光切割DNA。
6、紫外燈下觀(guān)察時(shí)應戴上防護鏡,以免損傷眼睛。
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