懸浮細胞的瞬時(shí)轉染操作

細胞轉染前的準備：

1.細胞：

貼壁生長(cháng)細胞：一般要求在轉染前一日，必須用胰酶處理成單細胞懸液，重新接種于培養皿或瓶，轉染當日的細胞密度以70%-90%（貼壁細胞），最好在轉染前2-4h換一次新鮮培養液。

懸浮細胞：轉染前12-16h進(jìn)行懸浮細胞傳代，傳代后適宜的細胞密度為20-40x10⁴/mL。臺盼藍染色進(jìn)行活細胞計數保持活細胞比在95%以上。

提前將293F細胞的密度調整至合適的密度后（2×106 - 4×106細胞/ml）于37°C搖床培養2-4h后進(jìn)行轉染。注意，參與轉染的細胞必須是培養三代或以上的穩定細胞株。

2.DNA：使用去內毒素質(zhì)粒大提試劑盒提取質(zhì)粒，于生物安全柜/超凈臺用0.22um濾頭過(guò)濾除菌。

3.稀釋液：于生物安全柜/超凈臺用0.22 μm濾頭過(guò)濾除菌。

4、轉染試劑：轉染試劑如PEI溶液長(cháng)期儲存于- 20℃，不可反復凍融，溶液在4℃放置不超過(guò)一周。

操作步驟（懸浮細胞）：

1、取一支已滅菌的Ep管，加入一定量的DNA，以相應體積的300 mM NaCl稀釋?zhuān)脴岊^混勻后靜置5 min；

另取一支已滅菌的Ep管，加入相應體積的300 mM NaCl稀釋對應體積的PEI溶液用槍頭混勻后靜置5 min（稀釋液與DNA、PEI的總體積應為轉染體積的5%）。

將質(zhì)粒和PEI溶液混合，槍頭混勻后靜置一段時(shí)間，使DNA與PEI形成穩定的聚合物。

2、從搖床中取出293F細胞。用1 mL移液槍滴緩慢滴加轉染混合液，邊加邊搖晃搖瓶使轉染更加充分。

3、轉染后將懸浮細胞置于搖床中培養，條件為37℃、8%CO2、110 rpm。每隔24 h進(jìn)行細胞計數并用臺盼藍染色液觀(guān)察細胞的存活率。

注意事項：

1、DNA純度：使用去內毒素的質(zhì)粒大提試劑盒，細菌產(chǎn)生的內毒素對細胞狀態(tài)有很大的影響。

用于轉染的質(zhì)粒DNA必須無(wú)蛋白質(zhì)，無(wú)RNA和其他化學(xué)物質(zhì)的污染，確保質(zhì)粒OD值A260/A280在1.8~2.0之間。

提完質(zhì)粒后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗驗證DNA的純度，通常情況下DNA為超螺旋狀態(tài)（此狀態(tài)下轉染效率更高）。

2、優(yōu)化條件

質(zhì)粒不同，所轉染的細胞不同及定量的準確性等因素會(huì )導致在一些情況下轉染效率低，蛋白表達量低，基于這種情況需要對質(zhì)粒轉染試劑的配比、DNA的濃度、質(zhì)粒與轉染試劑的聚合時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化。

3、轉染的稀釋液

研究報道，300 mM NaCl溶液稀釋DNA和轉染試劑轉染效率比普通培養基高。

以上就是本期的內容，更多資訊，歡迎點(diǎn)擊安培生物網(wǎng)站鏈接了解更多技術(shù)與產(chǎn)品資訊。

安培生物致力成為推動(dòng)生命科學(xué)進(jìn)步值得信賴(lài)的合作者

深圳/湛江安培生物科技有限公司,是一家具有核心的技術(shù)實(shí)力、先進(jìn)的經(jīng)營(yíng)管理水平和完善的市場(chǎng)銷(xiāo)售體系的生物高科技企業(yè)?？偛吭O在廣東，服務(wù)面向全國。安培生物集進(jìn)口試劑、實(shí)驗室耗材銷(xiāo)售、技術(shù)服務(wù)與合約開(kāi)發(fā)為一體的專(zhuān)業(yè)化高科技公司，旨在為生命科學(xué)的發(fā)展提供較好的產(chǎn)品與服務(wù)。本公司建立了涵蓋分子生物學(xué)、細胞生物學(xué)、免疫學(xué)、信號傳導和神經(jīng)科學(xué)等領(lǐng)域的產(chǎn)品供應線(xiàn)，在各個(gè)領(lǐng)域內向用戶(hù)提供較高的水平和質(zhì)量穩定的產(chǎn)品，安培生物致力于為廣大的科研機構、高等院校等客戶(hù)提供各種產(chǎn)品、技術(shù)支持與服務(wù)。

可以在第一時(shí)間為用戶(hù)提供比較先進(jìn)的專(zhuān)業(yè)資訊和完備的產(chǎn)品和物流服務(wù)。 專(zhuān)業(yè)的技術(shù)力量使得我們能夠為廣大用戶(hù)提供強大的技術(shù)支持，深厚的人脈資源使得我們在全國主要城市擁有眾多的合作伙伴，安培生物非常榮幸能將世界上先進(jìn)的高科技產(chǎn)品推薦給國內從事生物學(xué)領(lǐng)域科研的老師和同仁。作為專(zhuān)業(yè)性的產(chǎn)品供應商，公司出資存備了大量現貨，配合優(yōu)秀的銷(xiāo)售隊伍以及專(zhuān)業(yè)的技術(shù)支持，隨時(shí)為客戶(hù)提供服務(wù)。