24條細胞培養經(jīng)驗

什么是細胞培養？

細胞培養（cell culture）是指在體外模擬體內環(huán)境（無(wú)菌、適宜溫度、酸堿度和一定營(yíng)養條件等），使之生存、生長(cháng)、繁殖并維持主要結構和功能的一種方法。細胞培養也叫細胞克隆技術(shù)，在生物學(xué)中的正規名詞為細胞培養技術(shù)。

不論對于整個(gè)生物工程技術(shù)，還是其中之一的生物克隆技術(shù)來(lái)說(shuō)，細胞培養都是一個(gè)非常重要的過(guò)程，細胞培養本身就是細胞的大規?？寺?。細胞培養技術(shù)可以由一個(gè)細胞經(jīng)過(guò)大量培養成為簡(jiǎn)單的單細胞或極少分化的多細胞，這是克隆技術(shù)中十分重要的環(huán)節，而且細胞培養本身就是細胞的克隆。

細胞培養技術(shù)是細胞生物學(xué)研究方法中重要和常用技術(shù)，通過(guò)細胞培養既可以獲得大量細胞，又可以借此研究細胞的信號轉導、細胞的合成代謝、細胞的生長(cháng)增殖等。

細胞培養總會(huì )遇到細胞污染、胞質(zhì)疏松，狀態(tài)不好，養不起來(lái)等等問(wèn)題。接下來(lái)就給你們介紹一些常見(jiàn)問(wèn)題解決方法。

細胞培養的菜鳥(niǎo)問(wèn)題集

1.冷凍管應如何解凍？

取出冷凍管后，須立即放入37°C水槽中快速解凍，輕搖冷凍管使其在1分鐘內全部融化，并注意水面不可超過(guò)冷凍管蓋沿，否則易發(fā)生污染情形。另冷凍管由液氮桶中取出解凍時(shí)，必須注意安全，預防冷凍管之爆裂。

2.細胞冷凍管解凍培養時(shí)，是否應馬上去除DMSO？

除少數特別注明對DMSO敏感之細胞外，絕大部分細胞株（包括懸浮性細胞），在解凍之后，可直接放入10-15ml新鮮培養基，待隔天再置換新鮮培養基以去除DMSO即可，如此可避免大部分解凍后細胞無(wú)法生長(cháng)或貼附之問(wèn)題。

3. 可否使用與原先培養條件不同的培養基？

不能。每一細胞株均有其特定使用且已適應之細胞培養基，若驟然使用和原先提供之培養條件不同之培養基，細胞可能無(wú)法立即適應，導致細胞狀態(tài)不好甚至死亡。

4. 可否使用與原先培養條件不同的血清？

不能。血清是細胞培養上一個(gè)極為重要的營(yíng)養來(lái)源，所以血清的種類(lèi)和品質(zhì)對于細胞的生長(cháng)會(huì )產(chǎn)生極大的影響。來(lái)自不同物種的血清，在一些物質(zhì)或分子的量或內容物上都有所不同，血清使用錯誤常會(huì )造成細胞無(wú)法存活。

5. 培養細胞時(shí)應使用多少濃度的CO2？5%還是10%，或根本沒(méi)有影響？

一般培養基中大都使用HCO3-/CO32-/H+作為pH的緩沖系統，而培養基中NaHCO3的含量將決定細胞培養時(shí)應使用的CO2濃度。當培養基中NaHCO3含量為每公升3.7 g時(shí)，細胞培養時(shí)應使用10% CO2；當培養基中NaHCO3為每公升1.5 g時(shí)，則應使用5% CO2 培養細胞。

6. 何時(shí)須更換培養基？

視細胞生長(cháng)密度而定，或遵照細胞株基本數據上之更換時(shí)間，按時(shí)更換培養基即可。

7. 培養基中是否須添加抗生素？

除于特殊篩選系統中外，一般正常培養狀態(tài)下，培養基中不應添加任何抗生素，但實(shí)際操作中有時(shí)會(huì )加入1%的青鏈霉素來(lái)避免細菌污染。

8. 貼壁細胞繼代時(shí)該使用多少濃度的trypsin-EDTA？

?

一般使用濃度為0.05% trypsin-0.53mM EDTA·4Na。第一次開(kāi)瓶后應立即少量分裝于無(wú)菌試管中，保存于–20 °C，避免反復冷凍解凍造成trypsin之活性降低，并可減少污染之機會(huì )。

9. 懸浮細胞應如何繼代處理？

一般僅需在原培養瓶中持續加入新鮮培養基，稀釋細胞濃度即可，若培養液太多，可將培養瓶口端稍微抬高，直到無(wú)法容納為止。分瓶時(shí)取出一部份含細胞的培養液至另一新的培養瓶，加入新鮮培養基稀釋至適當濃度，重復前述步驟即可。

10. 一般動(dòng)物細胞的離心速率應為多少轉速？

欲回收動(dòng)物細胞，其離心速率一般為300 g (約1,000 rpm)，5-10分鐘，過(guò)高轉速將造成細胞死亡。

11. 合適的細胞接種密度是多少？

依照細胞株基本數據上的接種密度或稀釋分盤(pán)的比例接種即可。細胞數太少或稀釋的太多亦可能會(huì )導致細胞生長(cháng)過(guò)慢。

12. 細胞冷凍培養基的成份是哪些？

動(dòng)物細胞冷凍保存時(shí)最常使用的冷凍培養基是含5-10% DMSO (dimethyl sulfoxide)和90-95 %原來(lái)細胞生長(cháng)用的新鮮培養基均勻混合之。注意：由于DMSO稀釋時(shí)會(huì )放出大量熱能，故不可將DMSO直接加入細胞液中，必須使用前先行配制完成、且需提前放在4 °C預冷。

13. DMSO的等級和無(wú)菌過(guò)濾方式？

冷凍保存使用的DMSO等級必須為T(mén)issue culture grade，其本身即為無(wú)菌狀況，第一次開(kāi)瓶后應立即少量分裝于無(wú)菌試管中，避光保存。若要過(guò)濾DMSO，則須使用耐DMSO的Nylon材質(zhì)濾膜。

14. 細胞凍存的步驟是什么？

凍存方法一：冷凍管置于4 °C 30~60 分鐘→ (-20 °C30 分鐘*) → -80 °C 16~18 小時(shí)(或隔夜) → 液氮槽vaporphase 長(cháng)期儲存。

凍存方法二：冷凍管置于已設定程序的可程序降溫機中每分鐘降1-3 °C至–80 °C以下，再放入液氮槽vapor phase長(cháng)期儲存。*-20 °C 不可超過(guò)1 小時(shí)，以防止冰晶過(guò)大，造成細胞大量死亡，亦可跳過(guò)此步驟直接放入-80°C 冰箱中，但存活率會(huì )降低。

15. 凍存時(shí)細胞密度為多少比較合適？

冷凍管內細胞數目一般為1x106 cells/ml vial，融合瘤細胞則以5x106cells/ml vial為宜。

16. 應如何避免細胞污染？

細胞污染的種類(lèi)可分成細菌、酵母菌、霉菌、病毒和霉漿菌。造成細胞污染的主要原因有無(wú)菌操作技術(shù)不當、操作室環(huán)境不佳、實(shí)驗耗材污染、血清污染和細胞來(lái)源污染等。嚴格的無(wú)菌操作技術(shù)、清潔的環(huán)境和品質(zhì)良好的細胞來(lái)源是避免污染的最好方法。

17. 如果細胞發(fā)生微生物污染時(shí)，應如何處理？

直接滅菌后丟棄之。

18. 支原體污染會(huì )對細胞培養有何影響？

支原體污染幾乎可影響細胞所有的生長(cháng)參數。故進(jìn)行實(shí)驗前，必須確認細胞為mycoplasma-free，實(shí)驗結果方有意義。

19. 偵測出細胞株有支原體污染時(shí)，該如何處理？

直接滅菌后丟棄是最佳的方法，以避免污染其它細胞株。但如果樣品比較珍貴，可以購買(mǎi)市面上現有的支原體去除試劑，嘗試拯救一下。

20. CO2培養箱的水盤(pán)如何保持清潔？

定期更換無(wú)菌蒸餾水或無(wú)菌去離子水(至少每?jì)芍芤淮?。

21. 為何培養基保存于4 °C冰箱中，顏色會(huì )偏暗紅色，且pH值會(huì )越來(lái)越偏堿性？

培養基保存在4 °C冰箱中， 培養基內的CO2會(huì )逐漸溢出，造成培養基越來(lái)越偏堿性。而培養基中的酸堿指示劑(通常為phenol red)的顏色也會(huì )隨堿性增加而更偏暗紅。

22. 各種細胞培養用的dish，flask是否均相同？

不同廠(chǎng)牌的dish或flask，其所coating的polymer不同，制造程序亦不同，但對大部分細胞沒(méi)有太大之影響，只有少數細胞可能會(huì )因使用不同廠(chǎng)牌的dish或flask而表現出生長(cháng)差異。

23. 購買(mǎi)的細胞冷凍管經(jīng)解凍后，為何會(huì )發(fā)生細胞數目太少的情形？

研究人員在解凍細胞后出現細胞數目太少，大都是因為離心過(guò)程操作上的失誤，造成細胞的物理性損傷，以及細胞流失。建議細胞解凍后不要立刻離心，待細胞生長(cháng)隔夜后再更換培養基即可。

24. 購買(mǎi)的細胞出現死亡率高或狀態(tài)不佳的可能原因？

研究人員在細胞培養時(shí)出現存活率不佳，常見(jiàn)原因可歸納為：培養基使用錯誤或培養基品質(zhì)不佳。血清使用錯誤或血清的品質(zhì)不佳。解凍過(guò)程錯誤。冷凍細胞解凍后，加以洗滌細胞和離心。懸浮細胞誤認為死細胞。培養溫度使用錯誤。細胞置于–80 °C太久。

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