蛋白質(zhì)互作研究方法

相當多的蛋白質(zhì)行使功能的時(shí)候并不是單打獨斗的，蛋白質(zhì)們通過(guò)蛋白質(zhì)相互作用形成復合體然后進(jìn)行工作。因此，研究蛋白質(zhì)的相互作用成為研究蛋白質(zhì)功能和作用機制的最為重要的環(huán)節之一。

1.酵母雙雜交系統

原理：很多真核生物的位點(diǎn)特異轉錄激活因子通常具有兩個(gè)可分割開(kāi)的結構域，即DNA特異結合域（DNA-binding domain,BD)與轉錄激活域（Transcriptional activationdomain, AD）。這兩個(gè)結構域各具功能，互不影響，但一個(gè)完整的激活特定基因表達的激活因子必須同時(shí)含有這兩個(gè)結構域，否則無(wú)法完成激活功能。

將兩待測研究蛋白（蛋白X與蛋白Y）分別與BD、AD結構域構建融合質(zhì)粒。將構建好的兩個(gè)質(zhì)粒轉入同一酵母細胞中表達，如果兩蛋白之間不存在相互作用，則下游基因（報告基因）不會(huì )轉錄表達；如果兩個(gè)蛋白存在相互作用，則BD與AD兩結構域空間上很接近，從而下游基因（報告基因）得到轉錄。判斷通過(guò)報告基因表達與否，即可判斷兩蛋白之間是否存在相互作用。

用酵母雙雜交系統能夠快速、直接分析已知蛋白之間的相互作用，并能尋找、分離與已知蛋白相互作用的配體，在研究抗原和抗體相互作用、發(fā)現新的蛋白質(zhì)和發(fā)現蛋白質(zhì)的新功能、篩選藥物作用位點(diǎn)及藥物對蛋白互作影響、建立基因組蛋白連鎖圖等方面應用廣泛。

2.免疫共沉淀

免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，Co-IP）是一種以抗體和抗原之間的專(zhuān)一性作用為基礎的用于研究?jì)蓚€(gè)蛋白相互作用的經(jīng)典方法。

原理：基于抗體與抗原（靶蛋白）之間的特異性結合，此時(shí)如果樣品溶液中存在能與靶蛋白相互作用的目的蛋白，會(huì )一同被拉下來(lái)，隨后利用SDS-PAGE，Western Blot等方法對得到的目標蛋白進(jìn)行分析，進(jìn)而證明兩者間的相互作用。

通俗點(diǎn)來(lái)說(shuō)，假設我們需要研究樣品中A蛋白和B蛋白之間是否存在一些相互作用，首先我們通過(guò)合適的方法處理樣本，將蛋白提取出來(lái)（同時(shí)不能破壞蛋白之間的相互作用），然后用預先結合了瓊脂糖珠或者磁珠的A蛋白抗體捕獲樣本中的A蛋白，那么與A蛋白結合的B蛋白也能一起沉淀下來(lái)。再將蛋白從珠子上裂解下來(lái)，對B蛋白進(jìn)行檢測，能檢測到，說(shuō)明B蛋白在之前的沉淀過(guò)程中隨著(zhù)A蛋白一起被拉下來(lái)了，進(jìn)而證明二者之間存在相互關(guān)系。

3.免疫熒光共定位

將免疫學(xué)方法（抗原抗體特異結合）與熒光標記技術(shù)結合起來(lái)研究特異蛋白抗原在細胞內分布的方法。一般用來(lái)驗證2種或3種蛋白是否存在共定位關(guān)系。

由于熒光素所發(fā)的熒光可在熒光顯微鏡下檢出，從而可對抗原進(jìn)行細胞定位。兩種不同的蛋白使用不同屬性的不同屬性的不同顏色熒光標記后，通過(guò)觀(guān)察顏色的變化確定是否有共定位，也可以使用軟件分析。

該技術(shù)的主要特點(diǎn)是：特異性強、敏感性高、速度快。主要缺點(diǎn)是：非特異性染色問(wèn)題尚未解決，結果判定的客觀(guān)性不足，技術(shù)程序也還比較復雜。

4.Pull-down實(shí)驗

pull-down實(shí)驗，又稱(chēng)拉下實(shí)驗，是一種體外親和純化技術(shù)。（這個(gè)實(shí)驗跟免疫共沉淀實(shí)驗很像，不同的是免疫共沉淀是在細胞里進(jìn)行的。）

原理：將一種蛋白質(zhì)固定于某種基質(zhì)上（如Sepharose）,但細胞抽提液經(jīng)過(guò)該基質(zhì)時(shí)，可與該固定蛋白相互作用的配體蛋白被吸附，而沒(méi)有被吸附的“雜質(zhì)"則隨洗脫液流出。被吸附的蛋白可以通過(guò)改變洗脫液或洗脫條件而回收下來(lái)。

為了更有效地利用pull odwn技術(shù)，可以將待純化的蛋白以融合蛋白的形式表達，即將“誘餌"蛋白與一種易于純化的配體蛋白相融合。1988年Smith等利用谷胱甘胎-S-轉移酶（GST）融合標簽從細菌中一步純化出GST融合蛋白。

GST Pull-Down實(shí)驗：利用DNA重組技術(shù)將已知蛋白與GST融合，而融合蛋白通過(guò)GST與固化在載體上的GTH（谷胱甘肽）親和結合。簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，我們假定a蛋白和b蛋白可能存在互作，將純化的融合GST的a蛋白和純化的b蛋白以及能特異性結合GST的Sephrose 4Bbeads混合在一起孵育一定時(shí)間，然后洗去未結合的蛋白，煮沸beads進(jìn)行SDS-PAGE電泳。通過(guò)Western blot檢測結果，我們可以看到GST-a蛋白和b蛋白所對應的條帶，即表明了a蛋白和b蛋白因發(fā)生相互作用而被GST-a pull down(GST對照只顯示一個(gè)條帶)

pull down技術(shù)可用于驗證已知蛋白或胎的相互作用，也可以用來(lái)篩選與已知蛋白或肽互作的未知蛋白或肽。但是在一定程度上不能真實(shí)反應細胞內蛋白質(zhì)之間的相互作用，因為在體外相互作用的蛋白質(zhì)在正常生理條件下不一定會(huì )相互結合。

5.親和純化質(zhì)譜（AP-MS）

AP-MS（Affinity Purification coupled MS）,即親和純化串聯(lián)質(zhì)譜分析。

原理：基于特異性抗體或其他親和試劑與靶標蛋白的親和作用，通過(guò)免疫共沉淀（co-Immunoprecipitation）將靶標蛋白與靶標蛋白的相互作用蛋白從復雜的生物體系中純化出來(lái)，進(jìn)而進(jìn)行質(zhì)譜檢測以鑒定靶標蛋白的相互作用蛋白。

經(jīng)典的AP-MS實(shí)驗通常包含以下4個(gè)關(guān)鍵步驟：1）細胞或組織的裂解；2）蛋白溶液與偶聯(lián)抗體的親和微珠的孵育；3）非特異性結合和背景蛋白的清洗以及特異性互作蛋白的洗脫；4）互作蛋白的質(zhì)譜檢測和分析。

6、雙分子熒光互補技術(shù)

雙分子熒光互補（Bimolecular fluorescence complementation, BiFC），該技術(shù)是利用熒光蛋白的特點(diǎn)來(lái)研究蛋白的相互作用。

熒光蛋白可從特定的位點(diǎn)被分開(kāi)，產(chǎn)生兩個(gè)非熒光活性片段即N端片段（N-fragment）和C端片段（C-fragment）（VN及VC）。當兩片段分別被融合到相互作用的蛋白上時(shí)，會(huì )因蛋白的相互作用力而被拉近、發(fā)生互補從而重新構建成有活性的熒光蛋白并在激發(fā)光下產(chǎn)生熒光。因此利用熒光顯微鏡就可以直接通過(guò)觀(guān)察熒光有無(wú)來(lái)判斷蛋白是否發(fā)生相互作用。

這是在活細胞中觀(guān)察蛋白相互作用的很好的方法。

這個(gè)方法還是存在假陽(yáng)性的，細胞里大量表達的分段的黃色熒光蛋白（YFP）可能會(huì )不受研究蛋白的結合與否而自己結合在一起，所以陰性對照的使用非常重要。

7.NanoBiT 蛋白互補技術(shù)