質(zhì)粒構建的心得分享

質(zhì)粒是我們日常實(shí)驗中比較常用的載體，其可以自主生長(cháng)，也能通過(guò)比較容易的方法進(jìn)行大量擴增，但往往單一的質(zhì)粒不能滿(mǎn)足實(shí)驗需求，需通過(guò)一系列方法進(jìn)行質(zhì)粒重組，我目前比較常用的方法也就是比較陳舊的酶切重組質(zhì)粒的方式，簡(jiǎn)易實(shí)驗過(guò)程如下圖：

在這個(gè)過(guò)程中，有幾個(gè)小Tips：

1.原載體的酶切位點(diǎn)由文獻、載體說(shuō)明書(shū)或者導師建議得來(lái)，選擇正確的酶切位點(diǎn)是重組質(zhì)粒開(kāi)始的第一步，常見(jiàn)的酶切體系如下：

上述體系適用于大多數酶切，不是特別難切開(kāi)的載體1μl內切酶足夠，酶切前計算好量，先加ddH2O，最后加內切酶。

2.酶切完成后，需要跑瓊脂糖膠鑒定酶切效果，配膠時(shí)注意選擇合適的膠濃度，原則是分子量越大，膠濃度越小。跑膠完成后紫外燈下一般會(huì )有兩段即為成功：載體和切下來(lái)的片段，根據結果進(jìn)行膠回收，注意切下來(lái)的片段不回收，膠回收完成后測濃度備用。

3.插入片段根據自己的實(shí)驗選擇，通常插入片段可以通過(guò)PCR而來(lái)，或者是一段由三方公司合成的序列，在連接開(kāi)始前也需要用同樣的兩個(gè)內切酶切出缺口。常見(jiàn)連接體系如下：

其中，加入載體和插入片段的量由說(shuō)明書(shū)得來(lái)，加樣前計算好量，先加ddH2O，最后加連接酶，由于連接體系較小，一般使用pcr管進(jìn)行。

4、為確保連接的順利進(jìn)行，務(wù)必保證連接酶和連接酶緩沖液配套使用，即使用同一廠(chǎng)家的，不能混用。

測序的準確性對于后續慢病毒感染是非常重要的，因此測序公司的選擇十分重要，尤其出現一些比較難測的結構如shRNA的發(fā)卡結構等，測序技術(shù)不成熟的話(huà)會(huì )一直報重疊峰或者測不通的情況。

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