永生化人腦微血管內皮細胞（HCMEC/D3）培養指南

簡(jiǎn)介：

 HCMEC/D3細胞系來(lái)自于癲癇患者手術(shù)切除的富含腦內皮細胞（CECs）的組織，并從中分離出人顳葉微血管。后續使用人端粒酶（hTERT）和SV40大T抗原的催化亞基通過(guò)慢病毒載體轉導，使細胞依次永生化后，通過(guò)有限稀釋克隆法選擇性分離CEC，最終鑒定所得的細胞，具有廣泛的腦內皮細胞表型特征?？杀磉_大量?jì)绕ぜ毎?；可在基質(zhì)膠上形成毛細血管樣結構；可作為人血腦屏障（BBB）模型?？捎糜谘芯?jì)绕ぜ毎?，血管，藥物攝取與主動(dòng)轉運機制等。

培養條件：

 內皮細胞專(zhuān)用基礎培養基-EMC培養基+5%FBS+1%內皮細胞生長(cháng)添加物和1%青霉素/鏈霉素溶液。置于37°C，5%CO2的培養箱中培養。

消化（10cm皿為例）：

1. 當單層培養細胞匯合達80%。

2. 棄去舊培養基，2mlPBS潤洗兩次。

3. 用1ml含0.25%ETDA的胰蛋白酶消化1-2min（在培養箱放1min，然后鏡下觀(guān)察變圓）。

4. 用1ml（血清）細胞培養基終止消化，九宮格法吹落細胞收集到離心管，以800-1000rpm，室溫離心5min。

傳代：

以1:2~1:3的比例傳代，離心棄去廢液，用2ml~3ml（血清）細胞培養基充分重懸細胞沉淀成單個(gè)細胞，以“"Z“"字打入含有7ml培養基的10cm培養皿中，輕柔十字晃勻不超過(guò)十下并靜置數分鐘后鏡下觀(guān)察，平穩放入培養箱中。

凍存：

1. 凍存液的配置為血清：二甲基亞砜(DMSO)=9:1。

2. 取長(cháng)勢良好，匯合度達80%-90%并無(wú)污染的細胞，消化離心后用1.5ml凍存液重懸后轉移至凍存管中，標記好細胞種類(lèi)、日期、操作者，放入恢復室溫的梯度凍存盒，一同放置于-80°C冰箱。

復蘇：

準備好離心管中放入3ml（血清）細胞培養基，并確保水浴鍋打開(kāi)并達到37°C，從-80°C冰箱取出目標凍存管，放入密封袋并在水浴鍋中迅速搖晃解凍<1min，與3ml培養基混合均勻。在1000rpm，離心5分鐘，棄去上清液，用新培養基重懸細胞為單個(gè)細胞狀態(tài)，加入10cm皿中，培養過(guò)夜。

注意事項：

1.ECM細胞培養基又稱(chēng)內皮細胞培養基，是專(zhuān)門(mén)為人類(lèi)微血管內皮細胞體外培養設計的最合適其生長(cháng)的（血清）細胞培養基，包括必需和非必需氨基酸、維生素、有機和無(wú)機化合物、激素、生長(cháng)因子、微量礦物質(zhì)和低濃度胎牛血清（5%）。

2.該培養基的配方能夠選擇性的促進(jìn)正常人類(lèi)微血管內皮細胞體外培養中的增殖和生長(cháng)。

3.嘗試過(guò)使用DMEM（高糖）培養基、M199培養基，考慮可能由于不含生長(cháng)因子，多代后細胞形態(tài)發(fā)生改變，碎片增多。

4.ECM細胞培養基中的數種成分是怕光的，所以推薦培養基不要長(cháng)時(shí)間暴露在光中。避光4°C保存，配好的培養基需要在一個(gè)月內使用。

5.HCMEC/D3細胞十分耐造，正常培養即可。

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