THP-1細胞的培養方法和注意事項

簡(jiǎn)介：

THP-1細胞是從急性單核細胞白血病患者外周血中分離出來(lái)的單核細胞，廣泛應用于單核細胞和巨噬細胞相關(guān)機制、信號通路等研究；形態(tài)和分化特性類(lèi)似于原代單核細胞和巨噬細胞，在體外，常用PMA（phorbol 12-肉豆酸酯13-乙酸酯）或1α，25(OH)2D3 (1α，25-二羥基維生素D3或vD3)誘導分化THP-1細胞為巨噬細胞。因此，THP-1單核細胞已被開(kāi)發(fā)為體外極化單核細胞來(lái)源的巨噬細胞的有吸引力的模型。

原理：

一、THP-1細胞的培養方法

1.細胞復蘇

準備工作：15/50mL的離心管，馬克筆，培養瓶（T25）/培養皿（直徑60mm），RPMI 1640培養基，胎牛血清（FBS），雙抗（PS），酒精瓶（消毒殺菌）+酒精棉球，離心管/試劑管架子，移液槍?zhuān)瑃ip頭（1000/200ul）。

（1）首先用酒精棉球擦拭細胞房的實(shí)驗臺子，將我們所需要上述物品放入臺子里，并用紫外照30min，此時(shí)打開(kāi)水浴鍋42℃。

（2）照完紫外后，將保存在-80℃或者液氮中的細胞拿出用一次手套包住并迅速放入42℃水浴鍋中，一般在1min中內解凍。

（3）通過(guò)傳遞箱將細胞拿進(jìn)細胞房，打開(kāi)照明，打開(kāi)細胞臺子的玻璃門(mén)，用酒精噴灑手和細胞凍存管將細胞拿進(jìn)臺子里，進(jìn)行細胞復蘇。

（4）配置培養基：以50ml離心管為例：RPMI 1640培養基+10% 胎牛血清+ 1%雙抗：500ul雙抗（PS）+5mL(10%)/7.5(15%)胎牛血清（FBS）+RPMI 1640培養基加至50mL，并做好標記（培養基成分+配置時(shí)間+個(gè)人標記（名字））。

（5）首先準備一只15ml離心管，將細胞凍存管內的細胞以及凍存液吸取至離心管中，加入2mL 步驟（4）中配置好的RPMI 1640培養基，700~800rpm ，低速離心5min。

（6）離心的時(shí)間，準備T25培養瓶或者直徑60mm的培養皿做好標記（細胞名稱(chēng)+復蘇時(shí)間+姓名）。離心完成后，棄上清，吸取1ml（血清）細胞培養基重懸細胞。

（7）吸取2-3ml新鮮培養基至準備好培養瓶或者培養皿中，再將1ml細胞重懸液吸取至T25瓶或培養皿，“十字"搖勻細胞。

（8）用酒精噴灑后，將細胞放入37℃，5%CO2培養箱中培養2-3天觀(guān)察細胞狀態(tài)。

注意：細胞在偏酸性環(huán)境中生長(cháng)更快，當培養基稍微變黃（呈橘紅色）時(shí)，比較適合細胞生長(cháng)。

2、細胞傳代

THP-1細胞為懸浮細胞且具有低密度依賴(lài)性，一般超過(guò)10^6/ml傳代，比例一般為1:3/1:4，因此目前利用的兩種傳代方式：

(1)半換液傳代（不用離心）:吸取培養瓶或者培養皿中的細胞移至新的培養瓶或者培養皿中，補足培養基2-3ml。

(2)傳統的離心傳代：將瓶子或皿中的細胞吸取至15mL離心管中，700-800rpm，離心5min；棄上清，吸取2-3ml新鮮培養基重懸細胞，分至新的培養瓶或者培養皿中并補足培養基2-3ml。

3、細胞凍存

（1）用10%DMSO：900ul FBS + 100ul DMSO （有毒小心操作）或直接用無(wú)血清細胞凍存液。

（2）收集生長(cháng)狀態(tài)較好的細胞于15 mL離心管中，一般細胞數目為5×10^6-10^7/ml，700-800 rpm離心5 min，在超凈工作臺中用槍頭盡量去掉上清。

（3）加入1 mL凍存液，輕輕吹勻。將細胞放入梯度降溫盒中，放入-80℃培養箱中幾天后，轉移至液氮中進(jìn)行長(cháng)期保存。

注意事項或培養方面的經(jīng)驗心得

（1）THP-1細胞凍存后復蘇困難，因此要保證凍存的細胞數目足夠5×10^5-10^6個(gè)cell/ml；否則細胞密度過(guò)低，復蘇后狀態(tài)不好。

（2）培養過(guò)程中如果存在細胞碎片，可等待細胞長(cháng)起來(lái)后，通過(guò)低速離心去除。

（3）細胞發(fā)生少量聚團時(shí)我們可以等待THP-1細胞密度擴大后改善這種情況，但發(fā)生嚴重聚團時(shí)我們可以提高血清（FBS）用量，或者適度吹散細胞。

（4）THP-1細胞在傳代后可能會(huì )出現貼壁現象，如輕微貼壁可以輕 吹收集細胞或者丟棄貼壁的細胞，貼壁較多時(shí)，可檢查培養條件是否合適。

THP-1細胞培養過(guò)程中復蘇困難、聚團問(wèn)題分析

1、復蘇困難

THP-1細胞對細胞密度具有高度依賴(lài)性。凍存時(shí)，密度一般為5×10^6-10^7/ml較為適宜；同時(shí)復蘇密度也有依賴(lài)性，建議不低于3×10^6/ml。當細胞傳過(guò)幾次代，狀態(tài)較好時(shí)，傳代密度維持在5×10^/ml-10^6/ml較為合適，超過(guò)2×10^6/ml可進(jìn)行傳代。培養過(guò)程中如有細胞碎片，等細胞密度增大后可以通過(guò)低速離心去除。

2、細胞聚團嚴重

細胞聚團可能是細胞營(yíng)養缺失或者受到損傷，所以共用了細胞膜，以便于彼此釋放的促進(jìn)生長(cháng)的因子可以被很快接收到，細胞生長(cháng)一段時(shí)間后，可吹打開(kāi)，離心，然后換液。另外，THP1細胞離心速度一般不要高于800rpm，實(shí)驗室常用600-700rpm，否則可能會(huì )導致細胞死亡。

（1）THP-1細胞在密度較稀時(shí)，有少量細胞聚團屬于正?，F象，我們需使用面積小的培養瓶（T25瓶）或者培養皿（直徑60mm），培養基用量也相應減少，不建議將聚團的細胞吹散，等待密度高時(shí)，細胞會(huì )自然分散開(kāi)。

（2）當細胞密度高時(shí)，聚團細胞比例高于30%時(shí)，聚團嚴重。細胞間界線(xiàn)不清晰，細胞團模糊且較大等現象，則這種細胞聚團是異常的。此時(shí)，若對細胞沒(méi)有做過(guò)任何外界刺激或實(shí)驗處理，可檢查培養條件，一般更換優(yōu)質(zhì)血清或提高血清用量看是否有助于解決聚團問(wèn)題。

安培生物致力成為推動(dòng)生命科學(xué)進(jìn)步值得信賴(lài)的合作者

深圳/湛江安培生物科技有限公司,是一家具有核心的技術(shù)實(shí)力、先進(jìn)的經(jīng)營(yíng)管理水平和完善的市場(chǎng)銷(xiāo)售體系的生物高科技企業(yè)?？偛吭O在廣東，服務(wù)面向全國。安培生物集進(jìn)口試劑、實(shí)驗室耗材銷(xiāo)售、技術(shù)服務(wù)與合約開(kāi)發(fā)為一體的專(zhuān)業(yè)化高科技公司，旨在為生命科學(xué)的發(fā)展提供較好的產(chǎn)品與服務(wù)。本公司建立了涵蓋分子生物學(xué)、細胞生物學(xué)、免疫學(xué)、信號傳導和神經(jīng)科學(xué)等領(lǐng)域的產(chǎn)品供應線(xiàn)，在各個(gè)領(lǐng)域內向用戶(hù)提供較高的水平和質(zhì)量穩定的產(chǎn)品，安培生物致力于為廣大的科研機構、高等院校等客戶(hù)提供各種產(chǎn)品、技術(shù)支持與服務(wù)。

可以在第一時(shí)間為用戶(hù)提供比較先進(jìn)的專(zhuān)業(yè)資訊和完備的產(chǎn)品和物流服務(wù)。 專(zhuān)業(yè)的技術(shù)力量使得我們能夠為廣大用戶(hù)提供強大的技術(shù)支持，深厚的人脈資源使得我們在全國主要城市擁有眾多的合作伙伴，安培生物非常榮幸能將世界上先進(jìn)的高科技產(chǎn)品推薦給國內從事生物學(xué)領(lǐng)域科研的老師和同仁。作為專(zhuān)業(yè)性的產(chǎn)品供應商，公司出資存備了大量現貨，配合優(yōu)秀的銷(xiāo)售隊伍以及專(zhuān)業(yè)的技術(shù)支持，隨時(shí)為客戶(hù)提供服務(wù)。