銷(xiāo)售熱線(xiàn)
                              
                19126518388
            
                              
        
                              
      
                              
      
                              
      
             
         
    
         
         

  
  
  
                              
    
                              
	  
                              
        
        
                              
 
                              
     
   
 
                               
         
                              
	   
                              
    
                              
  
                              
      

                              
  
                              
    
                                
      
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                                分子克隆實(shí)驗的注意事項和經(jīng)驗分享
                                
                
                                
                  發(fā)布時(shí)間： 2024-01-16　　點(diǎn)擊次數： 297次  
                
                                
                
                                
                 
                                簡(jiǎn)介：
                                  分子克?。ɑ蚩寺?DNA重組/載體構建）技術(shù)是一種在分子水平上操作的技術(shù)，用于將特定的DNA片段從供體生物中分離出來(lái)，然后通過(guò)體外重組、轉化和轉導等方法，將其插入到適合的克隆載體中，并將重組克隆載體引入到合適的寄主體內進(jìn)行復制與擴增?？梢詰糜诘鞍妆磉_、病毒包裝、基因治療、細胞治療、mRNA疫苗、RNA干擾、細胞功能等研究。

                                圖片

                                具體操作流程：
                                一、聚合酶鏈式反應（PCR）
                                DNA聚合酶以單鏈DNA為模板，借助一小段雙鏈DNA來(lái)啟動(dòng)合成，通過(guò)一個(gè)或兩個(gè)人工合成的寡核苷酸引物與單鏈DNA模板中的一段互補序列結合，形成部分雙鏈。在適宜的溫度和環(huán)境下，DNA聚合酶將脫氧單核苷酸加到引物3'-OH末端，并以此為起始點(diǎn), 沿模板5'→3'方向延伸，合成一條新的DNA互補鏈。
                                （1）PCR反應基本成分：
                                ①模板DNA
                                基因組DNA上的某個(gè)基因或DNA片段；也可以是mRNA反轉錄產(chǎn)生的cDNA鏈。
                                ②引物
                                先由引發(fā)酶（一種特殊的RNA聚合酶）在DNA模板上合成一段RNA鏈，它提供引發(fā)末端被稱(chēng)為引物，接著(zhù)由DNA聚合酶從RNA引物3^端開(kāi)始合成新鏈。
                                ③dNTPs 
                                (dATP、dCTP、dGTP和dTTP) 是PCR反應中靶DNA序列擴增的原料。在PCR反應中每種脫氧核苷三磷酸的濃度以50-200μmol/L為宜, 不能低于10-15μmol/L。
                                ④DNA聚合酶
                                該片段具有聚合酶活性和3'→5'外切核酸酶活性, 能識別和消除錯配的引物末端, 以校正復制過(guò)程中錯配的核苷酸。
                                通過(guò)雙鏈DNA的高溫變性 (denaturation)，目的是要使雙鏈DNA解鏈成單鏈。引物與模板的低溫退火 (annealing) ，作用是使模板DNA單鏈或上一輪的反應產(chǎn)物與引物相結合。適溫延伸 (extension)，引物延伸是DNA聚合酶將脫氧單核苷酸逐一地加到引物3'-OH末端, 依據模板序列合成一條互補新鏈的過(guò)程。這三步反應反復循環(huán)。每一循環(huán)中所合成的新鏈, 又都可作為下一循環(huán)中的模板。
                                （2）反應體系（50ul體系）
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                                （3）反應程序：
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                                二、線(xiàn)性化載體
                                在目標載體質(zhì)粒上選取合適的位點(diǎn)進(jìn)行單酶切或雙酶切，對酶切后的載體進(jìn)行割膠純化。
                                環(huán)形雙鏈的質(zhì)粒DNA分子具有三種不同的構型：
                                ①當其兩條多核苷酸鏈均保持著(zhù)完整的環(huán)形結構時(shí),稱(chēng)之為共價(jià)閉合環(huán)形DNA（cccDNA）,這樣的DNA通常呈現超螺旋的SC構型；
                                ②如果兩條多核苷酸鏈中只有一條保持著(zhù)完整的環(huán)形結構,另一條鏈出現有一至數個(gè)缺口時(shí),稱(chēng)之為開(kāi)環(huán)DNA（ocDNA）,此即OC構型；
                                ③若質(zhì)粒DNA經(jīng)過(guò)適當的核酸內切限制酶切割之后,發(fā)生雙鏈斷裂形成線(xiàn)性分子（IDNA）,通稱(chēng)L構型。
                                線(xiàn)性化之后的質(zhì)粒比正常質(zhì)粒在瓊脂糖凝膠電泳中跑的慢。

                                三、純化PCR、酶切產(chǎn)物并連接
                                將反應結束的產(chǎn)物進(jìn)行純化，純化所選用的方法對污染的風(fēng)險有極大影響。一般而言，只要能夠得到可靠的結果，純化的方法越簡(jiǎn)單越好，目前有多種試劑盒可供選擇；
                                連接線(xiàn)性化載體和PCR產(chǎn)物，可根據DNA連接酶試劑盒說(shuō)明書(shū)設置，對于較大的片段可以選擇4℃連接過(guò)夜。

                                四、細菌轉化
                                冰上解凍克隆感受態(tài)細胞（DH5α）；取重組產(chǎn)物，加至感受態(tài)細胞中，冰上靜置30min，42℃水浴熱激45s，迅速置于冰上2-3min；加入600μL LB液體培養基,37℃搖菌1h。

                                五、菌落PCR
                                用滅過(guò)菌的 10ul 小槍頭挑取單克隆白斑至滅菌水中，振蕩混勻。然后用正常的 PCR 反應程序可。
                                PCR正常反應結束后用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，選擇正確條帶的菌液加入對應的培養基，37℃搖起來(lái)。

                                注意事項：
                                聚合酶鏈式反應
                                ①所有試劑都應該沒(méi)有核酸和核酸酶的污染。操作過(guò)程中均應戴手套。
                                ②PCR 試劑配制應使用最高質(zhì)量的新鮮雙蒸水。
                                ③試劑或樣品準備過(guò)程中都要使用一次性滅菌的塑料瓶和管，玻璃器皿應洗滌干凈并高壓滅菌。
                                ④PCR 的樣品應在冰浴上化開(kāi)，并且要充分混勻。
                                質(zhì)粒轉化
                                ①冰上解凍感受態(tài)細胞：大腸桿菌經(jīng)過(guò)低溫（0度)預處理的低滲cacl2溶液，造成細胞膨脹，細胞膜通透性發(fā)生改變，即易與外源DNA相黏附并在細胞表面形成復合物。
                                ②熱激轉化利用氯化鈣來(lái)產(chǎn)生富含鈣離子的環(huán)境，從而抵消質(zhì)粒DNA和細菌細胞膜之間的靜電排斥。溫度的急劇提高可以在細菌胞膜表面形成小孔，質(zhì)粒DNA就可進(jìn)入細菌細胞。
                                菌落PCR
                                ①在做菌落 PCR 的時(shí)候，每次都要做陰性、陽(yáng)性對照，陽(yáng)性對照可以用抽提好的質(zhì)?；蚧蚪M，這樣可以確定 PCR 主反應液的配制沒(méi)有問(wèn)題。
                                ②菌落PCR反應程序變性94℃4-5min即可保證外源DNA釋放出來(lái)。
                                安培生物致力成為推動(dòng)生命科學(xué)進(jìn)步值得信賴(lài)的合作者
                                深圳/湛江安培生物科技有限公司,是一家具有核心的技術(shù)實(shí)力、先進(jìn)的經(jīng)營(yíng)管理水平和完善的市場(chǎng)銷(xiāo)售體系的生物高科技企業(yè)?？偛吭O在廣東，服務(wù)面向全國。安培生物集進(jìn)口試劑、實(shí)驗室耗材銷(xiāo)售、技術(shù)服務(wù)與合約開(kāi)發(fā)為一體的專(zhuān)業(yè)化高科技公司，旨在為生命科學(xué)的發(fā)展提供較好的產(chǎn)品與服務(wù)。本公司建立了涵蓋分子生物學(xué)、細胞生物學(xué)、免疫學(xué)、信號傳導和神經(jīng)科學(xué)等領(lǐng)域的產(chǎn)品供應線(xiàn)，在各個(gè)領(lǐng)域內向用戶(hù)提供較高的水平和質(zhì)量穩定的產(chǎn)品，安培生物致力于為廣大的科研機構、高等院校等客戶(hù)提供各種產(chǎn)品、技術(shù)支持與服務(wù)。
                                 
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