PCR 操作中必知的 6 大細節

1、最好使用一次性進(jìn)口 tip 頭，以避免液體殘留；同時(shí)，tip 頭不要長(cháng)時(shí)間暴露于空氣中，避免氣溶膠的污染。

2、加樣時(shí)，tip 頭要伸入 PCR 反應管的液面下一點(diǎn)，然后將液體緩緩打入液面下，至恰好打出一個(gè)小氣泡為至；加樣過(guò)程最好在冰塊上操作；移液槍用完之后要歸到最大計量的位置，防止久而久之彈簧失去彈性，而導致加樣量的不準確。

3、配制反應體系時(shí)，若反應物為凍結制品，需在融解后上下顛倒輕輕均勻混合；加入試劑之前，把它混勻一下，以免放置時(shí)間長(cháng)了濃度不均；按照液體體積由大到小的順序將反應物加入到 PCR 管中；引物和模板和體系所加的比例要合適，模板過(guò)量反而會(huì )抑制體系的反應。

4、 操作多份樣品時(shí)，可先制備反應混合液，即將 dNTP、緩沖液、引物和酶混合好后分裝，這樣即可避免污染，又可增加反應的精確度。

5、避免反應液飛濺,打開(kāi)反應管時(shí)為避免此種情況,開(kāi)蓋前稍離心；PCR 產(chǎn)物的電泳檢測時(shí)間一般為 48h 以?xún)?，有些最好于當日電泳檢測，大于 48h 后帶型不規則甚至消失。

6、如凝膠分析擴增產(chǎn)物只有一條帶，不需要用凝膠純化。如可見(jiàn)其他雜帶，可能是積累了大量引物的二聚體。少量的引物二聚體的摩爾數也很高，這會(huì )產(chǎn)生高比例的帶有引物二聚體的克隆，而非目的插入片段。為此需在克隆前做凝膠純化。

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