銷(xiāo)售熱線(xiàn)
                              
                19126518388
            
                              
        
                              
      
                              
      
                              
      
             
         
    
         
         

  
  
  
                              
    
                              
	  
                              
        
        
                              
 
                              
     
   
 
                               
         
                              
	   
                              
    
                              
  
                              
      

                              
  
                              
    
                                
      
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                                技術(shù)文章ARTICLE
                                
            
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                                標記抗體的應用技術(shù)
                                
                
                                
                  發(fā)布時(shí)間： 2023-04-12　　點(diǎn)擊次數： 676次  
                
                                
                
                                
                 
                                原理
                                ELISA是以免疫學(xué)反應為基礎，將抗原、牽9體的特異性反應與酶對底物的高效催化作用相結合起來(lái)的一種敏感性很高的試驗技術(shù)。由于抗原、抗體的反應在一種固相載體──聚苯乙烯微量滴定板的孔中進(jìn)行，每加入一種試劑孵育后，可通過(guò)洗滌除去多余的游離反應物，從而保證試驗結果的特異性與穩定性。在實(shí)際應用中，通過(guò)不同的設計，具體的方法步驟可有多種。即：用于檢測抗體的間接法、用于檢測抗原的雙抗體夾心法以及用于檢測小分子抗原或半抗原的抗原競爭法等等。比較常用的是ELISA雙抗體夾心法及ELISA間接法。
                                　
                                材料與儀器
                                BSA 血清
                                碳酸鹽緩沖液 PBS 蒸餾水 磷酸棗檸檬酸 四甲基聯(lián)苯胺
                                塑料板 ELISA檢測儀 加樣器 滴頭 毛巾 洗滌瓶 燒杯 玻璃棒 試管 吸管 量筒 冰箱 孵育箱
                                步驟
                                一、用于檢測未知抗原的雙抗體夾心法

                                1. 包被

                                用0.05 M PH9 牰碳酸鹽包被緩沖液將抗體稀釋至蛋白質(zhì)含量為1～10 μg/ml。在每個(gè)聚苯乙烯板的反應孔中加0.1 ml，4 ℃過(guò)夜。次日，棄去孔內溶液，用洗滌緩沖液洗3次，每次3分鐘。（簡(jiǎn)稱(chēng)洗滌，下同）。

                                2. 加樣

                                加一定稀釋的待檢樣品0.1 ml于上述已包被之反應孔中，置37 ℃孵育1 小時(shí)。然后洗滌。（同時(shí)做空白孔，陰性對照孔及陽(yáng)性對照孔）。
                                　　
                                3. 加酶標抗體

                                于各反應孔中，加入新鮮稀釋的酶標抗體（經(jīng)滴定后的稀釋度）0.1 ml。37 ℃孵育0.5～1 小時(shí)，洗滌。
                                　　
                                4. 加底物液顯色

                                于各反應孔中加入臨時(shí)配制的TMB底物溶液0.1 ml，37 ℃10～30 分鐘。
                                　　
                                5. 終止反應

                                于各反應孔中加入2 M硫酸0.05 ml。
                                　
                                6. 結果判定

                                （1）可于白色背景上，直接用肉眼觀(guān)察結果。

                                反應孔內顏色越深，陽(yáng)性程度越強，陰性反應為無(wú)色或極淺，依據所呈顏色的深淺，以“+"、“-"號表示。

                                （2）可測OD值

                                在ELISA檢測儀上，于450 nm（若以ABTS顯色，則410 nm）處，以空白對照孔調零后測各孔OD值，若大于規定的陰性對照OD值的2.1倍，即為陽(yáng)性。

                                二、用于檢測未知抗體的間接法

                                1. 用包被緩沖液將已知抗原稀釋至1～10 μg/ml，每孔加0.1 ml，4 ℃過(guò)夜。次日洗滌3 次。
                                　　　　　　　　　　　　　　
                                2. 加一定稀釋的待檢樣品（未知抗體）0.1 ml于上述已包被之反應孔中，置37 ℃孵育1小時(shí)，洗滌。（同時(shí)做空白、陰性及陽(yáng)性孔對照）
                                　　　　　　　　　　　　　　
                                3. 于反應孔中，加入新鮮稀釋的酶標第二抗體（抗體）0.1 ml，37 ℃孵育30-60 分鐘，洗滌，最后一遍用DDW洗滌。
                                　　　　　　　　　　　
                                4. 其余步驟同“雙抗體夾心法"的4、5、6。
                                　　
                                注意事項
                                1. 正式試驗時(shí)，應分別以陽(yáng)性對照與陰性對照控制試驗條件，待檢樣品應作一式二份，以保證實(shí)驗結果的準確性。有時(shí)本底較高，說(shuō)明有非特異性反應，可采用羊血清、兔血清或BSA等封閉。
                                　　
                                2. 在ELISA中，進(jìn)行各項實(shí)驗條件的選擇是很重要的，其中包括
                                　　
                                （1）固相載體的選擇

                                許多物質(zhì)可作為固相載體，如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺和纖維素等。其形式可以是凹孔平板、試管、珠粒等。目前常用的是40孔聚苯乙烯凹孔板。不管何種載體，在使用前均可進(jìn)行篩選：用等量抗原包被，在同一實(shí)驗條件下進(jìn)行反應，觀(guān)察其顯色反應是否均一性，據此判明其吸附性能是否良好。
                                　　
                                （2）包被抗體（或抗原）的選擇

                                將抗體（或抗原）吸附在固相載體表面時(shí)，要求純度要好，吸附時(shí)一般要求PH在9.0～9.6之間。吸附溫度，時(shí)間及其蛋白量也有一定影響,一般多采用4 ℃18～24 小時(shí)。蛋白質(zhì)包被的最適濃度需進(jìn)行滴定：即用不同的蛋白質(zhì)濃度（0.1、1.0和10 μg/ml等）進(jìn)行包被后，在其它試驗條件相同時(shí)，觀(guān)察陽(yáng)性標本的OD值。選擇OD值最大而蛋白量最少的濃度。對于多數蛋白質(zhì)來(lái)說(shuō)通常為1～10 μg/ml。
                                　　
                                （3）酶標記抗體工作濃度的選擇

                                首先用直接ELISA法進(jìn)行初步效價(jià)的滴定。然后再固定其它條件或采取“方陣法“（包被物、待檢樣品的參考品及酶標記抗體分別為不同的稀釋度）在正式實(shí)驗系統里準確地滴定其工作濃度。
                                　　
                                （4）酶的底物及供氫體的選擇

                                對供氫體的選擇要求是價(jià)廉、安全、有明顯地顯色反應，而本身無(wú)色。有些供氫體（如OPD等）有潛在的致癌作用，應注意防護。有條件者應使用不致癌、靈敏度高的供氫體，如TMB和ABTS是目前較為滿(mǎn)意的供氫體。底物作用一段時(shí)間后，應加入強酸或強堿以終止反應。通常底物作用時(shí)間，以10-30分鐘為宜。底物使用液必須新鮮配制，尤其是H2O2在臨用前加入。

                                深圳安培生物科技有限公司，是一家具有核心的技術(shù)實(shí)力、壹流的經(jīng)營(yíng)管理水平和完善的市場(chǎng)銷(xiāo)售體系的生物高科技企業(yè)?？偛吭O在廣東，服務(wù)面向全國。安培生物集進(jìn)口試劑、實(shí)驗室耗材銷(xiāo)售、技術(shù)服務(wù)與合約開(kāi)發(fā)為一體的專(zhuān)業(yè)化高科技公司，旨在為生命科學(xué)的發(fā)展提供壹流的產(chǎn)品與服務(wù)。本公司建立了涵蓋分子生物學(xué)、細胞生物學(xué)、免疫學(xué)、信號傳導和神經(jīng)科學(xué)等領(lǐng)域的產(chǎn)品供應線(xiàn)，在各個(gè)領(lǐng)域內向用戶(hù)提供世界前沿水平和質(zhì)量穩定的產(chǎn)品，安培生物致力于為廣大的科研機構、高等院校等優(yōu)質(zhì)客戶(hù)提供優(yōu)質(zhì)的產(chǎn)品、技術(shù)支持與服務(wù)。

                                
                
                                
                
            
                                
        
                                
     
                                
     
                                
   
                                
 
                                
 
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