PEG 介導的脾細胞與骨髓瘤細胞的融合

（一）試劑配制

（1）HAT 選擇培養液 常用兩種儲存液（100xHT 和 100xA）來(lái)稀釋配制 HAT 培養液。

① 100xHT 稱(chēng)取次黃-嘌-呤 136.1 mg 和胸腺嘧啶核苷 38.8 mg，加細胞培養用水至 100 ml。若溶解不佳，加熱（70 ℃）助溶。100 倍儲存液中，次黃-嘌-呤濃度為 10 mmol/L，胸苷為 1.6 mmol/L。0.22 μm 濾膜過(guò)濾除菌，分裝，-20 ℃ 保存，可保存 1 年。

② 100xA 稱(chēng)取氨基蝶呤 1.76 mg，溶解于細胞培養用水中。加 1.0 mol/L NaOH 0.5 ml 助溶，再用 1 mol/L HC1 將 pH 調回至中性，定容至 100 ml。注意勿調成酸性，因為氨基蝶呤對酸敏感。100 倍儲存液中氨基蝶呤的濃度為 0.04 mmol/L。0.22 μm 濾膜過(guò)濾除菌，分裝，-20 ℃ 保存，可保存 1 年。

③ 將 100xHT 和 100xA 各按 1:100 比例加到含小牛血清的完-全培養基中，即成 HAT 選擇培養液。其中各成分的最終濃度分別為：H,1x10-4 mol/L;A,4x10-7 mol/L;T,1.6x10-5 mol/L。 

（2）100xHT 培養液 10 mmol/L 次黃-嘌-呤鈉鹽；1.6 mmol/L 胸腺嘧啶脫氧核苷。

（二）準備脾細胞

（1）處死動(dòng)物并用乙醇擦拭腹部，剖開(kāi)腹部暴露脾臟。

（2）用滅菌的鑷子和剪刀取出脾臟，置于一盛有 50 ml 滅菌 PBS 的燒杯中，洗去血污。

（3）把脾臟移入一盛有 20 ml 滅菌 PBS 的培養皿中。除去所有的多余組織和脂肪，并用 PBS 沖洗脾臟。

（4）把脾臟移入盛有 20 ml 滅菌 PBS 的培養皿，用滅菌的剪刀、鑷子剪碎組織，制成單細胞懸液。

（5）收集細胞于 50 ml 離心管，用 10 ml 滅菌的 PBS 清洗培養皿并轉移入離心管。靜置 1 min。

（6）小心把細胞懸液移入一新的離心管，不要讓管底的組織塊一并轉入。

（7）用 10 ml 滅菌的 PBS 清洗有組織塊的離心管，靜置 1 min 后小心移出細胞懸液，并和上一次的細胞懸液混合。

（8）室溫下以 800 g 離心 5 min。

（9）小心棄上清液。用 50 ml 滅菌的 PBS 重懸細胞，重復離心。

（10）小心棄上清液。在 10 ml 滅菌的 PBS 中重懸細胞。

（11）取 1 滴進(jìn)行細胞計數。

（三）準備骨髓瘤細胞

（1）從 2～4 個(gè)培養瓶中收集處于對數生長(cháng)期的骨髓瘤細胞。

（2）用滅菌的 PBS 清洗細胞，800 g 離心 5 min。

（3）重復洗滌、離心一次。

（4）用 10 ml 滅菌的 PBS 重懸細胞。

（5）取 1 滴進(jìn)行細胞計數。

（四）融合步驟

（1）以 3:1～5:1（脾細胞：骨髓瘤細胞）的比例在 50 ml 離心管中混合脾細胞和骨髓瘤細胞（細胞總數約為 106）。室溫下 800 g 離心 5 min。

（2）盡可能地棄去上清液。輕叩管底使沉淀松動(dòng)，置 37 ℃（39 ℃ 更佳）水浴中預溫。

（3）緩慢逐滴加入 1 ml 37 ℃ 預溫的 50％ PEG 溶液，邊加邊輕搖混勻，加完后用吸管輕輕吹打混勻。37 ℃ 靜置 1 min。

（4）用 20 ml 滅菌的 PBS 稀釋 PEG。注意動(dòng)作一定要緩慢，尤其是開(kāi)始稀釋時(shí)（最初 1 ml 在 1 min 內加完，之后可加快速度）。800 g 離心 5 min，棄上清液。

（5）重復洗滌、離心一次。

（6）棄上清。在 HAT 培養液中重懸沉淀，使細胞密度為 5x105 個(gè)/ml

（7）轉入 96 孔培養板，每孔 0.2 ml。在 CO2 培養箱中 37 ℃ 培養

 5～7 d，其間根據需要換 HAT 培養液。

（8）觀(guān)察細胞融合結果。