Nunc細胞工廠(chǎng)

1. 用胰蛋白酶消化后，將細胞懸浮，計數細胞，用 2 L 培養液將懸液稀釋至細胞密度為 2x104 個(gè)/ml。

2. 使小室長(cháng)邊朝下，放置，將培養液供應管與 Luer 連接管相接，再通過(guò)供應管與底孔連通。

3. 經(jīng)供應管加入細胞和培養液。所有培養小室內的液體將達到相同水平。

4. 按單層細胞平面將小室轉動(dòng) 90度，使單元的短邊朝下，放置，使進(jìn)孔和供應管朝上。

5. 在 Luer 連接管處，中斷供應管與培養液儲存器的連接。

6. 與細胞單層平面垂直，將培養小室轉動(dòng) 90度，以底部放平，使培養面呈水平位。

7. 用 5% CO2 空氣向單元充氣 5 min，然后夾住供應管和出口。如果需要，可連續充氣。

8. 倒掉供應管和出口內的培養液，然后將單元移入培養箱。

9. 更換培養液（或收集培養液）時(shí)，按步驟 6 的相反程序操作。除去輸入管上的濾器，然后按步驟 4 相反程序操作。

10. 擦洗 Luer 連接管，松開(kāi)夾具，使培養液流出。

11. 按步驟 2~8 更換培養液。

12. 收集細胞。

(a)按步驟 9 和步驟 10 除去培養液。

(b)加入 500 ml D-PBSA，然后除去。

(c)加入 4℃的 500 ml 胰蛋白酶，30 s 后除去。

(d)用剩余的胰蛋白酶將細胞消化 15 min。

(e)加入培養液，搖動(dòng)培養小室，使細胞懸浮。

(f)按步驟 9 和步驟 10 取出含細胞的培養液。

13. 殘留細胞可用于接種下一批細胞，雖然這種方法難以控制接種密度。最好是將培養小室丟棄，用新的小室重新開(kāi)始培養。

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