銷(xiāo)售熱線(xiàn)
                              
                19126518388
            
                              
        
                              
      
                              
      
                              
      
             
         
    
         
         

  
  
  
                              
    
                              
	  
                              
        
        
                              
 
                              
     
   
 
                               
         
                              
	   
                              
    
                              
  
                              
      

                              
  
                              
    
                                
      
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                                T淋巴細胞轉化實(shí)驗
                                
                
                                
                  發(fā)布時(shí)間： 2023-01-10　　點(diǎn)擊次數： 646次  
                
                                
                
                                
                 
                                原理
                                T 細胞在體外培養時(shí)，受到非特異性有絲分裂原（如PHA、ConA）刺激后，可出現細胞體積增大，代謝旺盛，蛋白和核酸合成增加,即向淋巴母細胞轉化。淋巴細胞轉化率的高低可以反映機體的細胞免疫水平，因此可作為測定機體免疫功能的指標之一。
                                 
                                淋巴細胞轉化試驗有形態(tài)計數法、MTT 法和同位素法三種。
                                 
                                MTT 法即四甲基偶氮唑鹽微量酶反應比色法。MTT 是一種噻唑鹽，化學(xué)名3-（4，5-二甲基-2-噻唑）-2，5-二苯基溴化四唑，水溶液為黃橙色。小鼠脾細胞受到ConA 作用后發(fā)生增殖活化，其胞內線(xiàn)粒體琥珀酸脫氫酶活性相應升高，MTT 作為其底物參與反應，形成藍色的甲臜（Formazan）顆粒沉積于細胞內或細胞周?chē)?，?jīng)鹽酸─異丙醇溶解后為藍色溶液，可用酶標測定儀測定細胞培養物的OD 值，測定波長(cháng)570 nm。根據OD 值的大小計算反應體系中細胞增殖程度。

                                3H-TdR 摻入法：細胞增殖的基本條件或前提為細胞質(zhì)和細胞核的復制，這是正常細胞增殖過(guò)程缺一不可的前提。一般來(lái)說(shuō)，一個(gè)細胞周期可大致分為四期，即G1 期、S期、G2 期和M期。其中S期為DNA合成期，主要功能活動(dòng)為DNA合成。3H-TdR即（甲基-3H）胸腺嘧啶核苷（[3H-methyl]thymidine），是DNA合成的前體。加入細胞培養液中后被細胞攝取作為DNA合成的原料。細胞合成的DNA越多，則所摻入的3H-TdR就越多，因此，檢測所摻入的3H-TdR就可反映細胞增殖的程度。因該方法有同位素污染問(wèn)題，故我們實(shí)習中仍用MTT法。
                                材料與儀器
                                ICR小鼠
                                RPMI1640培養液 Hank's液 刀豆蛋白A MTT 碘酒 酒精
                                無(wú)菌尖吸管 刻度吸量管 無(wú)菌解剖器械 平底培養板 CO2培養箱 酶標測定儀
                                步驟
                                1.  小鼠脾細胞懸液的制備
                                 
                                取一個(gè)滅菌的平皿，加入5 ml Hank's液。頸椎脫臼法處死小鼠，取脾臟，放入平皿中，在鋼網(wǎng)上研磨并過(guò)篩，制成細胞懸液。取出100 μl用于計數。將其余細胞懸液移入一離心管中，離心1500 rpm，7 min，（或1000 rpm，10  min）棄去上清，用RPMI1640 培養液稀釋?zhuān)瞥?.5×106 /ml的脾細胞懸液，然后加入ConA使每孔最終濃度為2 μg/ml，同時(shí)做不加ConA的陰性對照孔。
                                2.  將上述細胞懸液加入96孔平底培養板中，每孔0.1 ml。
                                 
                                3.  將培養板放入含有5 %CO2的37 ℃培養箱中培養48-72 小時(shí)，在培養結束前4-6 小時(shí)，于培養板各孔內加入1 mg/mlMTT液，10 μl/孔。37 ℃培養6 小時(shí)。
                                4.  各孔內加入0.01 M 鹽酸—異丙醇110 μl，30 分鐘內（或加2 %SDS100 ul/孔，過(guò)夜）用酶標測定儀測OD 值，測定波長(cháng)570 nm。
                                注意事項
                                1.  由于本實(shí)驗需要培養3 天，才能觀(guān)察結果。因此，在操作時(shí)應注意無(wú)菌操作，避免細菌污染，導致實(shí)驗的失敗。
                                 
                                2.  細胞操作要輕柔、迅速，以免細胞損傷影響實(shí)驗結果。





                                 
                                常見(jiàn)問(wèn)題
                                一、實(shí)驗結果

                                將實(shí)驗組和對照組三個(gè)復孔的 OD 值平均。
                                 
                                轉化值=實(shí)驗組的平均OD 值-對照組的平均OD 值。

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