哺乳動(dòng)物細胞瞬時(shí)基因轉移法制備重組蛋白實(shí)驗

一、轉染方法

對于脂質(zhì)體轉染 (Upofection), 可以從商業(yè)途徑獲得許多配方，這些配方都具有單一的專(zhuān)（禾刂）化組分，而且毫無(wú)疑問(wèn)，它們中的大部分都能非常有效地將質(zhì)粒 D N A 轉 人 細 胞 。其缺點(diǎn)是價(jià)格不菲—- 在使用這些試劑時(shí)，對于超出數百毫升規模的瞬時(shí)轉染，經(jīng)濟上是不可行的。大規模的瞬時(shí)轉染方法要求轉染試劑能很容易大量獲取, 批次間的變化小以保證轉染的一致性。盡管也存在一些其他的選擇，如將殼聚糖 (chitosan) 及其衍生物和14D E A 2 作為轉染試劑（D a n g and L e o n g , 2006; Jiang and Sharfstein， 2008; K u s u m o t oet a L ， 2 〇〇 6)，但磷酸鈣（calcium phosphate) 介導的轉染以及基于聚乙烯亞胺 (polyethylenimine，PEI) 的質(zhì)粒絡(luò )合 (plasmidcomplexation) 和細胞攝人是僅有的滿(mǎn)足這些要求的兩種常用技術(shù)。

1.利 用 聚 乙 烯 亞 胺 在 W a v e ™ 生物反應 器 中 進(jìn) 行 大 規 模 瞬 時(shí) 轉 染

近些年 ，一 次 性的 W a v e ™ 生物反應器得到了普遍的認可，因為相對于經(jīng)典的攪拌釜反應器，其保養和操作更加容易。雖 然 100 L 工作體積的反應器也實(shí)現了商業(yè)化，擁有300 L 工作體積的樣機也在開(kāi)發(fā)之中, 但最為常用的反應器的工作體積是 10 L 和 20 L 。是否 使用 W a v e ™ 生物反應器進(jìn)行 10 L 以下的轉染取決于經(jīng)濟可行性—我們更傾向于使
用搖瓶進(jìn)行小規模的生產(chǎn) ( F e m b a c h flasks， Corning)。據報道，也有其他的反應器或振搖設備成功的用于瞬轉培養（Muller et al. ， 2005; P h a m et aL , 2006; Stettler et al.，2007)。

下面介紹以 H E K 293 T 細胞為宿主，使 用 M 11V 3 無(wú)血清培養基 (Novartis proprietary) 進(jìn)行 10 L 規模的抗體生產(chǎn)的方法。 抗體的兩條鏈都克隆至同一個(gè)表達載體。

(1) 將一個(gè) 20 L 的 W a v e ™ 袋（Sartorius Stedim Biotech, G 6ttingen， G e r m a n y ) 安裝 到 W a v e ™ 工 作 平 臺（W a v e - Bioreactor S P S 5O ) ，并連接到一個(gè) D A S G I P 氣體混合模塊上（D A S G I P ， Juelich， G e r m a n y )。然后，在 袋 中 接 種 4 L H E K 293T 細胞培養物，細胞密度約 為 I.8 X IO6 個(gè)細胞/m L 。

(2) 我 們 采 用 了 下 列 過(guò) 程 參 數 和 條 件 : 氣 體 流 速 2 〇 L /h ; 混 合 氣 體 包 括 2 1 % ?2 5 % 〇 2、0 % C O 2; 溫度 37°C ; p H 6. 8?7, 4; 搖擺速率 10 r Z m i n; 搖擺角度 7°

(3) 將 10 m g 質(zhì) 粒 D N A (1 m g /m L ) 與 M 11V 3 培養基混合至終體積為 500 m L , 室溫孵育 10 m i n 。然 后 ，用 0. 22 p m 的 G P E X P R E S S P L U S 濾 膜（Millipore, Billerica,
M A ) 將稀釋后的 D N A 溶液過(guò)濾除菌。

⑷ 將 3 〇 m L P E I 溶 液（I m g /m L ) 與 500 m L M l l V 3 培 養 基 混 合 ，室溫孵育10 m i n 。然后 用 0.22um 的 G P E X P R E S S P L U S 濾膜將稀釋后的 P E I 溶液過(guò)濾除菌。

注意:P E I 儲存液在使用前是應當無(wú)菌的，經(jīng)過(guò)過(guò)濾的，分 裝 并 凍 存 于 一 80°C 直至使用。

(5) 接下來(lái)，將 P E I 溶液加至 D N A 溶液中，室溫孵育 15 m i n 以形成多聚絡(luò )合物。

(6) 無(wú)菌條件下，將 D N A -P E I -M 11V 3 混合物加至 W a v e ™ 袋中的細胞培養物中, 終體 積 為 5 L 。繼續用下列參數孵育 5?6 h : 氣體流速 M L /h ; 混合氣體包括 2 5 % O 2、〇 %CO2; 溫度 37°〇 ; 口 1^6.8?7.4; 搖擺速率 1 〇 r/min; 搖擺角度 7°。

(7) 然后，向 5 L M 11V 3 培養基中補加 100 m L R X l 組合補料 (補料含有氨基酸、葡萄 糖 和 谷 氨 酰 胺 ；由 Irvine Scientific， Santa A n a , C A 定 做），無(wú) 菌 條 件 下 將 其 加 至W a v e ™ 袋的細胞中。在生產(chǎn)期，采 用 如 下 參 數 : 氣 體 流 速 30?40 L /h ; 混合氣體包括3 〇 %?4 〇 % O 2、0 % C O 2; 溫 度 37°C ; p H 6. 8?7.4(用 p H 9.2 的碳酸氫鹽溶液調整，Sigm a Aldrich, B u c h s , Switzerland); 氣體飽和度 6 0 % ?100%; 搖擺速 率 14?18 r/mi. n ; 搖擺角度 7°。

(8) 轉染的細胞在 W a v e ™ 生物反應器中培養 10 天 ，以生產(chǎn)抗體。
注 意 : 為了生產(chǎn)重組蛋白，生 產(chǎn) 期 通 常 為 5?7 天 ，但如果目標蛋白質(zhì)對蛋白酶解敏感 ，這個(gè)時(shí)間可以縮短?？贵w分子的生產(chǎn)時(shí)間可延長(cháng)至 1 0 天 。

(9) 每天取樣，用 V 1 -Cell 細 胞 計 數 設 備（B e c k m a n Coulter) 測定細胞密度和成活率 。用 Bioprofile 400 分析儀 (Labor-Systeme Fliickiger, Switzerland) 測定營(yíng)養狀態(tài)、p H
及氣體飽和度。用 蛋白 A 高壓液相測定 I g G 濃度（圖 15. 1)。

(10) 10 天后，在無(wú)菌條件下收集細胞，橫流過(guò)濾（cross-flow filtration) (FreseniusFilter P l a s m a F l u x， 0.2 fim) 以 除 去 細 胞 。然 后 將 無(wú) 細 胞 的 上 清 液 用 中 空 纖 維 過(guò) 濾(hollow fiber filtration)(H e m o f l o w F 10 H P S , Fresenius, Stans, Switzerland, 10 k D acutoff) 的方法濃縮 10 倍 。

(11) 用 Protein A 親和色譜和分子篩色譜對濃縮液進(jìn)行純化。對上述這些標準方法有多種改進(jìn), 這些改進(jìn)后的方法已經(jīng)經(jīng)過(guò)測試并發(fā)表，其中的一些在下面簡(jiǎn)短列出。

① 在 利用 C H O 細胞系進(jìn)行生產(chǎn)的過(guò)程中，通過(guò)轉換溫度至 30?32°C 提高表達速率(Backliwal et al. ， 2008a ; Galbraith et al. ， 2006)。

② 用微管解聚劑諾考達唑（nocodazole) 處 理 細 胞 使 其 細 胞 周 期 停 滯 在 G 2/M 期(Tait et a L ， 2004)。

③ 用抑制劑，如丁酸鈉（sodium butyrate)、丙 戊 酸（valproic acid) 處 理 去 抑 制 C H O和 H E K 293 細胞的組蛋白脫乙?；福╤istone deacetylase) 及 D N A 甲基轉移酶（D N Amethyl transferase) (Backliwal et al. , 2008c)。

④ 對細胞系進(jìn)行遺傳改造，以阻止凋亡 (apoptosis) 或克服未折疊蛋白質(zhì)應答 (unfolded protein response,U P R ) 造成的抑制作用（Backliwal et al. , 2008c; Majors et al. ，2007； Tigges and Fussenegger, 2006) ?

結論

正如該領(lǐng)域中已經(jīng)發(fā)表的大量數據所反映的那樣, 過(guò)去幾年，就技術(shù)發(fā)展和產(chǎn)量而言 ，通過(guò)瞬時(shí)轉染技術(shù)制備重組蛋白已經(jīng)達到了一個(gè)令人印象深刻的狀態(tài)。不過(guò)，盡管有報道指出，利用大規模瞬時(shí)轉染技術(shù)在生物反應器中生產(chǎn)蛋白質(zhì)，已能獲得相當高的抗體滴度—大 于 I g / W B a c k l i w a l et al. ， 2008a)，但現在就想用它替換過(guò)程繁瑣的構建細胞系方法用于生物治療藥物的生產(chǎn)還為時(shí)尚早。我們通過(guò)對 1 〇〇多個(gè)瞬時(shí)轉染表達實(shí)驗的觀(guān)察表明，對于不同的基因，表達量變動(dòng)很大: 一般蛋白質(zhì)的表達量從 I m g / L 到超過(guò)170 m g /L ; 抗體的平均表達量為 20?40 m g /L ，但常常分布在兩個(gè)（木及）端。毫無(wú)疑問(wèn), 在表達載體設計、培養條件優(yōu)化和可能的細胞系改造方面, 我們還需要進(jìn)一步的技術(shù)改進(jìn), 但這種方法總體上令人印象深刻的成功證明了這種努力是值得的。