基因敲除的原理與方法詳解

一.概述：

基因敲除是自80年代末以來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種新型分子生物學(xué)技術(shù)，是通過(guò)一定的途徑使機體特定的基因失活或缺失的技術(shù)。通常意義上的基因敲除主要是應用DNA 同源重組原理，用設計的同源片段替代靶基因片段，從而達到基因敲除的目的。隨著(zhù)基因敲除技術(shù)的發(fā)展，除了同源重組外，新的原理和技術(shù)也逐漸被應用，比較成功的有基因的插入突變和iRNA ，它們同樣可以達到基因敲除的目的。

二.實(shí)現基因敲除的多種原理和方法：

1.利用基因同源重組進(jìn)行基因敲除

基因敲除是80年代后半期應用DNA 同源重組原理發(fā)展起來(lái)的。80年代初，胚胎干細胞(ES細胞)分離和體外培養的成功奠定了基因敲除的技術(shù)基礎。1985年，第一次證實(shí)的哺乳動(dòng)物細胞中同源重組的存在奠定了基因敲除的理論基礎。到1987年，Thompsson第一次建立了完整的ES細胞基因敲除的小鼠模型[1]。直到現在，運用基因同源重組進(jìn)行基因敲除依然是構建基因敲除動(dòng)物模型中尤為普遍的使用方法。

(1)利用同源重組構建基因敲除動(dòng)物模型的基本步驟：

①. 基因載體的構建：把目的基因和與細胞內靶基因特異片段同源的DNA 分子都重組到帶有標記基因(如neo 基因，TK 基因等)的載體上，成為重組載體?；蚯贸菫榱耸鼓骋换蚴テ渖砉δ?，所以一般設計為替換型載體。

②.ES 細胞的獲得：現在基因敲除一般采用是胚胎干細胞，尤為常用的是鼠，而兔，豬，雞等的胚胎干細胞也有使用。常用的鼠的種系是129及其雜合體，因為這類(lèi)小鼠具有自發(fā)突變形成畸胎瘤和畸胎肉瘤的傾向，是基因敲除的理想實(shí)驗動(dòng)物。而其他遺傳背景的胚胎干細胞系也逐漸被發(fā)展應用。

③.同源重組：將重組載體通過(guò)一定的方式(電穿孔法或顯微注射)導入同源的胚胎干細胞(ES cell)中，使外源DNA 與胚胎干細胞基因組中相應部分發(fā)生同源重組，將重組載體中的DNA 序列整合到內源基因組中，從而得以表達。一般地，顯微注射命中效率較高，但技術(shù)難度較大，電穿孔命中效率比顯微注射低，但便于使用。

④.選擇篩選已擊中的細胞：由于基因轉移的同源重組自然發(fā)生率極低，動(dòng)物的重組概率為10-2 ～10-5 ，植物的概率為10-4 ～10-5 。因此如何從眾多細胞中篩出真正發(fā)生了同源重組的胚胎干細胞非常重要。目前常用的方法是正負篩選法(PNS法)，標記基因的特異位點(diǎn)表達法以及PCR 法。其中應用最多的是PNS法。

⑤.表型研究：通過(guò)觀(guān)察嵌和體小鼠的生物學(xué)形狀的變化進(jìn)而了解目的基因變化前后對小鼠的生物學(xué)形狀的改變，達到研究目的基因的目的。

⑥.得到純合體：由于同源重組常常發(fā)生在一對染色體上中一條染色體中,所以如果要得到穩定遺傳的純合體基因敲除模型，需要進(jìn)行至少兩代遺傳。

(2)條件性基因敲除法

條件性基因敲除法可定義為將某個(gè)基因的修飾限制于小鼠某些特定類(lèi)型的細胞或發(fā)育的某一特定階段的一種特殊的基因敲除方法。它實(shí)際上是在常規的基因敲除的基礎上，利用重組酶Cre介導的位點(diǎn)特異性重組技術(shù)，在對小鼠基因修飾的時(shí)空范圍上設置一個(gè)可調控的“按鈕”，從而使對小鼠基因組的修飾的范圍和時(shí)間處于一種可控狀態(tài)。

條件性敲除的原理:

利用Cre/LoxP 和來(lái)自酵母的FLP—frt 系統可以研究特定組織器官或特定細胞中靶基因滅活所導致的表型[7]。通過(guò)常規基因打靶在基因組的靶位點(diǎn)上裝上兩個(gè)同向排列的1oxP，并以此兩側裝接上loxP 的(“loxP floxed”)ES 細胞產(chǎn)生“loxPfloxed”小鼠,然后，通過(guò)將“loxP floxed”小鼠與Cre 轉基因鼠雜交(也可以其他方式向小鼠中引入Cre 重組酶)，產(chǎn)生靶基因發(fā)生特定方式(如特定的組織特異性)修飾的條件性突變小鼠。在“loxP floxed”小鼠，雖然靶基因的兩側已各裝上了一個(gè)loxP，但靶基因并沒(méi)有發(fā)生其他的變化，故“1oxP noxed”小鼠表型仍同野生型的一樣。但當它與Cre 轉基因小鼠雜交時(shí)，產(chǎn)生的子代中將同時(shí)帶有“loxP floxed”靶基因和Cre 基因。Cre 基因表達產(chǎn)生的Cre 重組酶就會(huì )介導靶基因兩側的1oxP 間發(fā)生切除反應，結果將一個(gè)loxP 和靶基因切除。這樣，靶基因的修飾(切除)是以Cre 的表達為前提的。Cre 的表達特性決定了靶基因的修飾(切除)持性：即Cre 在哪一種組織細胞中表達，靶基因的修飾(切除)就發(fā)生在哪種組織細胞;而Cre 的表達水平將影響靶基因在此種組織細胞中進(jìn)行修飾的效率。所以只要控制Cre 的表達特異性和表達水平就可實(shí)現對小鼠中靶基因修飾的特異性和程度。

(3)誘導性基因敲除法

誘導性基因敲除也是以Cre/loxp 系統為基礎，但卻是利用控制Cre 表達的啟動(dòng)子的活性或所表達的Cre 酶活性具有可誘導的特點(diǎn)，通過(guò)對誘導劑給予時(shí)間的控制或利用Cre 基因定位表達系統中載體的宿主細胞特異性和將該表達系統轉移到動(dòng)物體內的過(guò)程在時(shí)間上的可控性，從而在1oxP 動(dòng)物的一定發(fā)育階段和一定組織細胞中實(shí)現對特定基因進(jìn)行遺傳修飾之目的的基因敲除技術(shù)。人們可以通過(guò)對誘導劑給予時(shí)間的預先設計的方式來(lái)對動(dòng)物基因突變的時(shí)空特異性進(jìn)行人為控制、以避免出現死胎或動(dòng)物出生后不久即死亡的現象。常見(jiàn)的幾種誘導性類(lèi)型如下：四環(huán)素誘導型;干擾素誘導型;激素誘導型;腺病毒介導型。

誘導性基因敲除優(yōu)點(diǎn)：

① 誘導基因突變的時(shí)間可人為控制;

② 可避免因基因突變而致死胎的問(wèn)題

③ 在2 個(gè)loxP 位點(diǎn)之間的重組率較高;

④如用病毒或配體/DNA 復合物等基因轉移系統來(lái)介導Cre 的表達，則可省去建立攜帶Cre 的轉基因動(dòng)物的過(guò)程。[10]

2.2利用隨機插入突變進(jìn)行基因敲除。

2.2.1 原理：

此法利用某些能隨機插入基因序列的病毒，細菌或其他基因載體，在目標細胞基因組中進(jìn)行隨機插入突變，建立一個(gè)攜帶隨機插入突變的細胞庫，然后通過(guò)相應的標記進(jìn)行篩選獲得相應的基因敲除細胞(原理見(jiàn)圖5)[11,12] 。根據細胞的不同，插入載體的選擇也有所不同。逆轉率病毒可用于動(dòng)植物細胞的插入;對于植物細胞而言農桿菌介導的T-DNA轉化和轉座子比較常用;噬菌體可用于細菌基因敲除。

2.2.2基因捕獲法

基因捕獲法是最近發(fā)展起來(lái)的利用隨機插入突變進(jìn)行基因敲除的新型方法，其原理可見(jiàn)圖6。通?；虿东@載體還包括一個(gè)無(wú)啟動(dòng)子的報道基因，通常是neo 基因，neo 基因插入到ES 細胞染色體組中，并利用捕獲基因的轉錄調控元件實(shí)現表達的ES 克隆可以很容易*地含有中靶基因。中靶基因的信息可以通過(guò)篩選標記基因側翼cDNA或染色體組序列分析來(lái)獲得[13]

2.2.3基因捕獲法的優(yōu)缺點(diǎn)

用常規方法進(jìn)行基因敲除研究需耗費大量的時(shí)間和人力，研究者必須針對靶位點(diǎn)在染色體組文庫中篩選相關(guān)的染色體組克隆，繪制相應的物理圖譜，構建特異性的基因敲除載體以及篩選中靶ES 細胞等，通常一個(gè)基因剔除純合子小鼠的獲得需要一年或更長(cháng)的時(shí)間。面對人類(lèi)基因組計劃產(chǎn)生出來(lái)的巨大的功能未知的遺傳信息，傳統的基因敲除方法顯得有些力不從心。因此，基因捕獲法應運而生，利用基因捕獲可以建立一個(gè)攜帶隨機插入突變的ES 細胞庫，節省大量篩選染色體組文庫以及構建特異打靶載體的工作及費用，更有效和更迅速地進(jìn)行小鼠染色體組的功能分析。

此方法的缺點(diǎn)是只能剔除在Es 細胞中表達的基因.單種的細胞類(lèi)型中表達的基因數目約為I04，現在的基因捕獲載體從理論上來(lái)講應能剔除所有在ES細胞表達的基因，因此，在ES 細胞中進(jìn)行基因捕獲還是大有可為的。用基因捕獲法進(jìn)行基因剔除的另一個(gè)缺點(diǎn)是無(wú)法對基因進(jìn)行精細的遺傳修飾，

2.3.RNAi引起的基因敲除。

由于少量的雙鏈RNA就能阻斷基因的表達，并且這種效應可以傳遞到子代細胞中,所以RNAi的反應過(guò)程也可以用于基因敲除。近年來(lái)，越來(lái)越多的基因敲除采用了RNAi這種更為簡(jiǎn)單方便的方法。

2.3.1 RNAi阻斷基因表達的機理

雙鏈RNA進(jìn)入細胞后，能夠在Dicer酶的作用下被裂解成siRNA，而另一方面雙鏈RNA還能在RdRP (以RNA為模板指導RNA合成的聚合酶RNA-directed RNA

polymerase，RdRP)的作用下自身擴增后，再被Dicer酶裂解成siRNA。SiRNA的雙鏈解開(kāi)變成單鏈，并和某些蛋白形成復合物，Argonaute2是目前惟一已知的參與復合物形成的蛋白。此復合物同與siRNA互補的mRNA結合，一方面使mRNA被RNA酶裂解，另一方面以SiRNA作為引物，以mRNA為模板，在RdRP作用下合成出mRNA的互補鏈。結果mRNA也變成了雙鏈RNA，它在Dicer酶的作用下也被裂解成siRNA。這些新生成的siRNA也具有誘發(fā)RNAi的作用，通過(guò)這個(gè)聚合酶鏈式反應，細胞內的siRNA大大增加，顯著(zhù)增加了對基因表達的抑制。從21到23個(gè)核苷酸的siRNA到幾百個(gè)核苷酸的雙鏈RNA都能誘發(fā)RNAi，但長(cháng)的雙鏈RNA阻斷基因表達的效果明顯強于短的雙鏈RNA。

2.3.2 RNAi基因敲除的優(yōu)點(diǎn)及應用

①.比用同源重組法更加簡(jiǎn)便，周期大大縮短。

②.對于哺乳動(dòng)物，如對于一些敲除后小鼠在胚胎時(shí)就會(huì )死亡的基因，可以在體外培養的細胞中利用RNAi技術(shù)研究它的功能。

③.由于RNAi能高效特異的阻斷基因的表達，它成為研究信號傳導通路的良好工具。

④.RNAi還被用來(lái)研究在發(fā)育過(guò)程中起作用的基因，如可用RNAi來(lái)阻斷某些基因的表達，來(lái)研究他們是否在胚胎干細胞的增殖和分化過(guò)程中其起著(zhù)關(guān)鍵作用。

2.4實(shí)現基因敲除的其他原理。

除上述幾種已經(jīng)比較成熟并且普遍使用了的基因敲除原理外，還有一些基于其他原理的敲除技術(shù)正處于研究和完善過(guò)程中，如TFOs(Triple helix forming oligonucleotides)引導的基因敲除術(shù)[16]以及反義技術(shù)在基因敲除技術(shù)中的運用等[17]。隨著(zhù)遺傳學(xué)，分子生物學(xué)理論的發(fā)展，新的基因敲除原理也在不斷的發(fā)現和發(fā)掘中。

3.基因敲除技術(shù)的應用及前景：

①.建立生物模型。在基因功能，代謝途徑等研究中模型生物的建立非常重要?；蚯贸夹g(shù)就常常用于建立某種特定基因缺失的生物模型，從而進(jìn)行相關(guān)的研究。這些模型可以是細胞，也可以是完整的動(dòng)植物或微生物個(gè)體。常見(jiàn)的是小鼠，家兔、豬、線(xiàn)蟲(chóng)、酵母和擬南芥等的基因敲除模型也常見(jiàn)于報道。

②.疾病的分子機理研究和疾病的基因治療。通過(guò)基因敲除技術(shù)可以確定特定基因的性質(zhì)以及研究它對機體的影響。這無(wú)論是對了解疾病的根源或者是尋找基因治療的靶目標都有重大的意義。

③.提供廉價(jià)的異種移植器官。器官來(lái)源稀少往往是人體器官的移植的一大制約因素，而大量廉價(jià)的異種生物如豬等的器官卻不能用于人體。這是因為異源生物的基因會(huì )產(chǎn)生一些能引起人體強烈免疫排斥的異源分子，如果能將產(chǎn)生這些異源分子的基因敲除，那么動(dòng)物的器官將能用于人體的疾病治療，這將為患者帶來(lái)具大的福音。如：PPL Therapeutics 公司于1999 年已成功地在豬的體細胞中用基因敲除技術(shù)敲除了α-1，3GT 基因。使每只豬都缺乏產(chǎn)生a1-3半乳糖基轉移酶的基因的2個(gè)拷貝。這些酶在細胞表面產(chǎn)生一種糖分子，人體的免疫系統可以立即辨認出這種糖分子為異源性，從而引發(fā)超急性免疫排斥反應。在缺乏這種酶的情況下，超急性排斥反應即不會(huì )再發(fā)生。

④.免疫學(xué)中的應用。同異源器官的移植相似，異源的抗體用于人體時(shí)或多或少會(huì )有一定的免疫排斥，使得人用抗體類(lèi)藥物的生產(chǎn)和應用受阻。而如果將動(dòng)物免疫分子基因敲除，換以人的相應基因，那么將產(chǎn)生人的抗體，從而解決人源抗體的生產(chǎn)問(wèn)題。

⑤改造生物、培育新的生物品種。細菌的基因工程技術(shù)是本世紀分子生物學(xué)史的一個(gè)重大突破，而基因敲除技術(shù)則可能是遺傳工程中的另一重大飛躍。它為定向改造生物，培育新型生物提供了重要的技術(shù)支持。

4.基因敲除技術(shù)的缺陷

隨著(zhù)基因敲除技術(shù)的發(fā)展，早期技術(shù)中的許多不足和缺陷都已經(jīng)解決，但基因敲除技術(shù)始終存在著(zhù)一個(gè)難以克服的缺點(diǎn)，即敲掉一個(gè)基因并不一定就能獲知該基因的功能，其原因包括：一方面，許多基因在功能上是冗余的，敲掉一個(gè)

在功能上冗余的基因，并不能造成容易識別的表型，因為基因家族的其他成員可以提供同樣的功能;另一方面，對于某些必需基因，敲除后會(huì )造成細胞的致死性，也就無(wú)法對這些必需基因進(jìn)行相應的研究了。

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