如何進(jìn)行蛋白樣品的制備？要注意些什么？

變性條件——SDS LB直接裂解：

用常溫或者高溫預熱過(guò)（預熱更有利于阻止蛋白水解或者磷酸酶去磷酸化，但容易遺忘，而LB久煮會(huì )改變某些性質(zhì)）的1*SDS LB（或者略高1.5*）直接加到細胞或者組織上并煮樣。

通常6孔板細胞80%以上密度，需200ul，其他按平板面積比類(lèi)推。通常條件下，SDS LB都是過(guò)量的（因此不一定要嚴格參考SDS LB稀釋比）；如果SDS LB不夠，樣品核酸、蛋白濃度過(guò)高時(shí)，煮樣后會(huì )發(fā)現tip吸不上來(lái)，非常粘、一砣一砣的，很容易堵住tip。

這時(shí)候常規做法有兩種：

1.再煮5min。常規煮樣時(shí)間3-5min，樣品過(guò)濃時(shí)就煮10min；

2.如果10min煮樣后，仍然吸不起來(lái)，才適當增加SDS LB，繼續煮；也可以對樣品進(jìn)行超聲。煮樣時(shí)間若過(guò)長(cháng)，蛋白會(huì )凝固，此時(shí)以失去繼續WB的意義，請丟棄（判斷標準：出現明顯的蛋白沉淀和水分層）

此方法的缺點(diǎn)是：SDS LB煮過(guò)的樣品如果用來(lái)做IP，需要特殊方法，因此，這種制備方法制備的樣品有使用局限。

非變性裂解法：

裂解細胞請盡量冰上操作，減緩酶解作用。

裂解液配方是：20mM Tris/HCl, pH7.6, 100mM NaCl, 20mM KCl,1.5mM MgCl2, 0.5% NP-40 and protease inhibitors (20μg/ml leupeptin,10μg/ml pepstatin A and 10 μg/mlaprotinin)（此裂解液可用于抽提核蛋白），其中蛋白酶抑制劑可用0.5mMPMSF替代；如果還要做磷酸化蛋白，加1mM Na3VO4（現加現用），10 mM NaF, 1 mM Na3VO4, 50 mMbeta-GP。

此方法的優(yōu)點(diǎn)：NaCl濃度略低于生理狀態(tài)，保證裂解細胞的方式較為溫和，便于隨后的IP等試驗。其他Na鹽濃度的細胞裂解液也很常見(jiàn)，諸如0.15M（生理鹽濃度）、0.3M、0.6M（高鹽系列，裂解細胞時(shí)染色體會(huì )析出，細胞碎片和沉淀非常粘稠）及0.8-1.2M；0.3M及以下適合 IP試驗，0.6M及以上適合純化蛋白，尤其相互作用較強的復合體，要得到純化的一些復合體的組成蛋白一般采用（木及）端的高鹽裂解細胞。

組織塊裂解：

組織塊較大用勻漿的方法最合適，現在有不少轉頭很小的勻漿器。

當組織超微量的時(shí)候，比如50mg新鮮癌組織，建議采用的方法是

1. 低溫（剪）攪碎，成肉糜狀。

2. 錫箔紙包裹好，放入少量液氮，快速敲擊（控制力量，盡量避免弄破錫箔紙），進(jìn)一步破碎；反復多次。

3. 用上述細胞裂解液回收。

分泌型蛋白富集：

用無(wú)血清培養基培養細胞，收集上清液用于WB檢測；如果含量過(guò)低，需要用TCA沉淀富集。

理論上，從普通培養基中收集分泌蛋白，此時(shí)對細胞生長(cháng)條件的影響最小，是最佳的實(shí)驗條件；但是這存在隱憂(yōu)。因為含血清的培養基中含有非常豐富的BSA（牛血清白蛋白）之類(lèi)的蛋白質(zhì)，除非你進(jìn)一步分離純化，否則直接用這種樣品去WB會(huì )有非常大的麻煩，尤其當你的蛋白在60-46kDa之間的時(shí)候；用“任何"抗體去檢測這一區間的蛋白，都會(huì )有一片非常強的信號。因為此區間蛋白（主要是BSA）濃度過(guò)于富集，會(huì )非特異性粘附“任意"抗體，從而最終被識別。同理，采用SDS LB裂解細胞制備樣品前，通常要用PBS洗滌，其目的之一是去除培養基中的BSA。

采用無(wú)血清培養基收集細胞上清除了改變細胞的生理狀態(tài)外（可能激活未知信號途徑，諸如AKT等），還會(huì )出現的問(wèn)題是：

1. 即使采用了無(wú)血清收集上清，仍然有大量雜蛋白，但相對好很多。

2. 選用了上清，由于蛋白濃度太稀，通常要采用TCA沉淀富集，再重新溶解。

a. TCA沉淀對半定量操作要求非常高，因為很容易沉淀不充分或者離心操作丟失，尤其在離心過(guò)程，離心管的擺放非常講究，要180度翻轉離心兩次。

b。重新溶解時(shí)，由于蛋白需要在一定的鹽離子條件下才能重新溶解，你要摸索充分溶解的條件，相對麻煩。

實(shí)際上，如果你不是非常強調蛋白的分泌有什么生理功能，一般不建議檢測上清，尤其半定量的WB實(shí)驗檢測不同樣品間的差異。