銷(xiāo)售熱線(xiàn)
                              
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                                制備YAC DNA進(jìn)行Southern印跡分析
                                
                
                                
                  發(fā)布時(shí)間： 2021-12-24　　點(diǎn)擊次數： 738次  
                
                                
                
                                
                 
                                材料與儀器
                                酵母菌
                                AHC SCE SCEM Tris·Cl EDTA TE 乙酸甲 RNase A 異丙醇 NaCl
                                培養箱 離心管 轉子
                                步驟

                                1.  接種一個(gè)紅色的含YAC克隆的酵母菌落于盛有20 ml AHC培養基的250 ml 三角燒瓶中，在旋轉搖床上30℃ 250 r/min 振蕩培養24 h。
                                 
                                2.  擴大培養：取1ml 由步驟1獲得的粉紅色菌懸液接種于盛有100 ml AHC培養基的 1 000 ml三角燒瓶中，于30℃ 250 r/min搖床培養24 h。

                                3.  將菌懸液移入2個(gè)50 ml 的錐形離心管中，于2 000 g 離心5 min，棄上清，共用5 ml SCE緩沖液重懸菌體，并合并到一個(gè)試管中。

                                4.  加1 ml SCEM緩沖液，在旋轉搖床中37℃ 100 r/min 輕搖晃混勻。

                                5.  于4℃ 2 000 g 離心棄上清，菌體用5 ml Tris/EDTA裂解液重懸。

                                6.  加0.5 ml 10%SDS顛倒混合數次，于65℃溫育20 min。
                                 
                                7.  加2 ml 冰浴的5 mol/l pH4.8的乙酸甲緩沖液，顛倒混合數次后置于冰浴60 min。

                                8.  于室溫2 000 g 離心10 min，小心將含核酸的上清轉移到一個(gè)新管中。加室溫2倍體積的95%乙醇，顛倒混勻。

                                9.  于室溫2 000 g 離心5 min，棄上清，在室溫晾干10~15 min，分別加入3 ml TE緩沖液，pH8.0于37℃過(guò)夜溶解核酸。

                                10.  加入0.1 ml 的1 mg/ml 無(wú)DNA酶活性的RNase A，于37℃溫育1 h。
                                 
                                11.  加入6 ml 室溫的異丙醇，振蕩并顛倒混勻后用一支毛細管纏繞起染色體，然后溶于0.5 ml TE緩沖液中。

                                12.  加入50 μl 5 mol/l NaCl和2 ml 95%乙醇，顛倒混勻。

                                13.  再一次纏繞起染色體DNA，并溶于0.5 ml TE緩沖液中，于4℃保存備用。
                                 
                                14.  取毎小份2 μg 的YAC DNA和15 μg 用以構建YAC文庫的某物種或個(gè)體的基因組DNA。

                                15.  采用幾種高頻切割的限制性?xún)惹忻高M(jìn)行酶切，接著(zhù)用單拷貝探針進(jìn)行雜交和核酸印跡分析。
                                 
                                16.   一旦通過(guò)核酸印跡實(shí)驗確證YAC克隆，那么可通過(guò)制備染色體凝膠校塊塞和進(jìn)行脈沖電場(chǎng)凝膠電泳，來(lái)明確重組YAC的大小并對其穩定性進(jìn)行初步評價(jià)。

                                同實(shí)驗其他方法
                                YAC 克隆的分析實(shí)驗
                                1.  用接種棒將含重組載體pYAC的AB1380菌株劃線(xiàn)接種在A(yíng)HC平板上，倒扣平板于30℃培養，直至長(cháng)出1~3 mm 大小的紅色菌落為止。 2.  短期保存：用Parafilm膜將平
                                以上就是本期的內容，更多資訊，歡迎點(diǎn)擊安培生物網(wǎng)站鏈接了解更多技術(shù)與產(chǎn)品資訊。

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