銷(xiāo)售熱線(xiàn)
                              
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                                哺乳動(dòng)物 DNA 的快速分離
                                
                
                                
                  發(fā)布時(shí)間： 2021-12-17　　點(diǎn)擊次數： 793次  
                
                                
                
                                
                 
                                原理
                                根據本方案制備的哺乳動(dòng)物 DNA 約 20~50 kb，適于作 PCR 反應的模板。DNA 產(chǎn)量在 0.5 到 3.0 μg/mg 組織之間變化，或者是 5~15 μg/300μl 全血。
                                材料與儀器
                                無(wú) DNase 的 RNase 蛋白酶 K 哺乳動(dòng)物組織或全血
                                細胞裂解緩沖液 乙醇 異丙醇 醋酸鉀溶液 紅細胞裂解緩沖液 TE
                                連有真空管的抽吸裝置 微量離心研棒 水浴
                                步驟
                                一、材料

                                1. 緩沖液及溶液

                                細胞裂解緩沖液（10 mmol/L Tris-Cl (pH 8.0)，1 mmol/L EDTA ( pH 8.0)，0.1%（m/V） SDS）

                                乙醇

                                異丙醇

                                醋酸鉀溶液（60 ml 的 5 mol/L 醋酸鉀，11.5 ml 冰醋酸，28.5 ml 水）

                                紅細胞裂解緩沖液（20 mmol/L Tris-Cl (pH 7.6)

                                TE ( pH 7.6)

                                2. 酶及緩沖液

                                無(wú) DNase 的 RNase ( 4 mg/ml)

                                蛋白酶 K ( 20 mg/ml)

                                3. 專(zhuān)用設備

                                連有真空管的抽吸裝置

                                微量離心研棒

                                預先調到 55℃ 或 65℃ 的水浴

                                4. 細胞和組織

                                哺乳動(dòng)物組織或全血

                                二、方法

                                1. 準備用于分離 DNA 的組織或全血

                                (1) 組織

                                ① 切下 10~20 mg 組織。

                                ② 用剃刀或解剖刀切碎組織或者將組織冷凍于液氮中，用在液氮中預冷的研缽研磨成粉。

                                (2) 血液

                                ① 在兩個(gè)微量離心管中分別轉移 300 μl 全血樣品。每管中加入 900 μl 紅細胞裂解緩沖液，蓋上蓋子，顛倒混勻。溶液于室溫下放置 10 min, 中間顛倒混勻幾次。

                                ② 室溫下用最大轉速離心 20 s。

                                ③ 每管保留 20 μl 上清，棄去其他部分。

                                ④ 用剩余的少量上清重懸白細胞沉淀。將兩管中的沉淀合成一管。

                                2. 將切碎的組織或者重懸的白細胞沉淀轉移到加有 600 μl 冰冷的細胞裂解緩沖液的離心管中。用微量研棒迅速研磨 30~50 下，混勻懸濁液。

                                3. (可選擇的）向裂解產(chǎn)物中加入 3 μl 蛋白酶 K, 以增加基因組 DNA 的產(chǎn)量。消化液置于 55℃ 放置 3 h 以上，但不要超過(guò) 16 h。

                                4. 消化液降至室溫，然后加入 3 μl 4 mg/ml 的無(wú) DNase 的 RNase。37℃ 放置 15~60 min。

                                5. 將樣品降至室溫。加入 200 μl 醋酸鉀溶液，劇烈振蕩 20s 使其充分混合。

                                6. 用最高轉速 4℃ 離心 3 min, 使蛋白/SDS 復合物沉淀出來(lái)。

                                7. 將上清轉移到加有 600 μl 異丙醇的新離心管中。充分混合，然后用最大轉速室溫下離心 1 min 收集 DNA 沉淀。

                                8. 吸去上清，加入 600 μl 70% 的乙醇。顛倒管子數次，用最大轉速室溫下離心 1 min。

                                9. 小心吸去上情，空氣中干燥 DNA 沉淀 15 min。

                                10. 將 DNA 沉淀溶解于 100 μl TE ( pH 7.6)。
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